一种基于溶血素O的单增李斯特菌检测试纸条及其制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于李斯特菌溶血素O(LLO)的单增李斯特菌检测试纸条及其制备方法与应用，检测方法涉及基于LLO的单增李斯特菌检测试纸条的制备标定或校准；应用校准后的单增李斯特菌检测试纸条利用加标回收方法检测牛奶或即食肉样品中单增李斯特菌浓度等。本发明专利技术提供的检测试纸条及其检测单增李斯特菌的方法具有直观准确、操作简便、检测时间短、成本低、适用范围广、储存简单、保质期长、易推广使用等优点，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于溶血素O的单增李斯特菌检测试纸条及其制备与应用
本专利技术涉及一种检测单增李斯特菌的试纸条及其制备与应用，尤其涉及一种基于李斯特菌溶血素O(ListeriolysinO，LLO)的单增李斯特菌检测试纸条及其制备与应用。
技术介绍
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，简称为单增李斯特菌)是一种人畜共患病的病原菌，对低温、高盐及消毒剂的抵抗力很强。该菌是一种腐生菌，以死亡的和正在腐烂的有机物为食，也是某些食物(主要是鲜奶产品)中的一种污染物，能引起严重食物中毒。人类摄入受单增李斯特菌污染的食物可以引起的李斯特菌病。李斯特菌病对免疫功能低下的患者、孕妇和新生儿具有较大的危害。因为单增李斯特菌会穿过肠屏障、血脑屏障和胎盘屏障，引起胃肠炎、脑膜炎、败血症、流产、妊娠并发症等疾病。目前很多国家都已经采取措施来控制食品中的单增李斯特菌，并制定了相应的标准。单增生李斯特菌引发的食品安全事件被广泛关注，它不仅会导致疾病的发生，严重时甚至还会引起感染者死亡，所以单增李斯特菌的快速检测技术显得至关重要。单增李斯特菌的传统培养检测法是先进行增菌，再经过氧化氢酶试验、溶血试验、血清学试验等进行鉴定，该方法操作繁琐、检测周期长无法对目标食物进行快速检测。鉴于分离培养检测方法存在的缺陷，许多新型的检测方法如酶联免疫吸附测定(ELISA)、DNA杂交和实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)等检测技术被开发出来。这些方法主要是基于单增李斯特菌的抗原或标志基因等标志物，利用ELISA、DNA杂交和qPCR来实现单增李斯特菌的检测。但是这些方法也存在假阳性或假阴性概率及检测周期长等问题。因此，建立一种简单快速的分析手段来检测食品中的单增李斯特菌具有重要现实意义和市场需求。
技术实现思路
针对现有检测单增李斯特菌方法的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种基于李斯特菌溶血素O(LLO)的单增李斯特菌检测试纸条及其制备与应用。本专利技术所述基于李斯特菌溶血素O(LLO)的单增李斯特菌检测试纸条的制备方法，步骤是：(1)制备纳米多孔金(NPG)：将厚度为100±10nm的Au/Ag合金片置于浓硝酸中，在(30～50)±2℃温度下，腐蚀0.5～4小时，制得NPG薄膜；其中，所述Au/Ag合金的重量比为Au40～48:Ag52～60；(2)制备NPG/CWE电极：准备具有1个工作电极、一个Ag/AgCl参比电极和一个碳对电极的试纸条，其中所述工作电极选择碳工作电极(CWE)，将制备的NPG薄膜固定于试纸条的工作电极CWE上，制备获得NPG/CWE电极；(3)制备CAT-Lipo/NPG/CWE生物电极：将磷脂酰胆碱、胆固醇和1-十八烷硫醇按照摩尔比9-10:9-10:1-2的比例混合在氯仿中，置于小口瓶中；然后用N2去除有机溶剂，在底部形成薄的脂质层；加入适量0.1～2.0M的邻苯二酚溶液溶解脂质层，并使脂质终浓度为0.1～9.0mgmL-1，然后在超声波清洗器中超声作用5～30分钟；再用探头式超声破碎仪以60～300W功率对溶液进行超声处理1～10分钟；之后，通过离心收集邻苯二酚-脂质体(CAT-Lipo)复合物，用50mM、pH7.0的PBS洗涤3～5次，去除游离的邻苯二酚；然后将CAT-Lipo复合物颗粒重新悬浮在50mM、pH7.0的PBS中，使其最终浓度为0.01～0.90mgμL-1；然后将1～70μL浓度为0.01～0.90mgμL-1的CAT-Lipo滴在NPG/CWE电极表面，制得CAT-Lipo/NPG/CWE生物电极。上述基于李斯特菌溶血素O(LLO)的单增李斯特菌检测试纸条的制备方法，优选以如下步骤完成：(1)制备纳米多孔金(NPG)：将厚度为100±5nm的Au/Ag合金片置于浓硝酸中，在40℃±2℃温度下，腐蚀1.5±0.5小时，制得NPG薄膜；其中，所述Au/Ag合金的重量比为Au50:Ag50；(2)制备NPG/CWE电极：准备具有1个工作电极、一个Ag/AgCl参比电极和一个碳对电极的试纸条，其中所述工作电极选择碳工作电极(CWE)，将制备的NPG薄膜固定于试纸条的工作电极CWE上，制备获得NPG/CWE电极；(3)制备CAT-Lipo/NPG/CWE生物电极：将磷脂酰胆碱、胆固醇和1-十八烷硫醇按照摩尔比10:10:1的比例混合在氯仿中，置于小口瓶中；然后用N2去除有机溶剂，在底部形成薄的脂质层；加入适量1.5M的邻苯二酚溶液溶解脂质层，并使脂质终浓度为8.0mgmL-1，然后在超声波清洗器中超声作用30分钟；再用探头式超声破碎仪以100W功率对溶液进行超声处理10分钟；之后，通过离心收集邻苯二酚-脂质体(CAT-Lipo)复合物，用50mM、pH7.0的PBS洗涤3次，去除游离的邻苯二酚；然后将CAT-Lipo复合物颗粒重新悬浮在50mM、pH7.0的PBS中，使其最终浓度为0.90mgμL-1；然后将5～40μL浓度为0.90mgμL-1的CAT-Lipo滴在NPG/CWE电极表面，制得CAT-Lipo/NPG/CWE生物电极。本专利技术所述方法制得的基于李斯特菌溶血素O(LLO)的单增李斯特菌检测试纸条。本专利技术所述基于李斯特菌溶血素O(LLO)的单增李斯特菌检测试纸条在检测单增李斯特菌中应用。本专利技术所述基于李斯特菌溶血素O(LLO)的单增李斯特菌检测试纸条在检测单增李斯特菌蛋白标志物LLO中的应用。其中，利用所述基于李斯特菌溶血素O(LLO)的单增李斯特菌检测试纸条对单增李斯特菌蛋白标志物LLO检测的方法是：(1)基于LLO的单增李斯特菌检测试纸条的表征：以本专利技术所述方法制得的基于李斯特菌溶血素O(LLO)的单增李斯特菌检测试纸条的CAT-Lipo/NPG/CWE生物电极为工作电极，以Ag/AgCl为参比电极，以碳电极为对电极，构建三电极检测体系；其中所述CAT-Lipo/NPG/CWE生物电极事先在0.5MH2SO4中进行循环伏安法扫描20圈，以还原峰峰电流表征CAT-Lipo/NPG/CWE生物电极的有效面积；(2)建立蛋白标志物LLO浓度与单增李斯特菌浓度线性关系：将单增李斯特菌接种于Trypticsoybroth(TSB)培养基中，然后放置于37℃摇床200rpm培养，并按间隔设定时间依次取样；首先依次将所取样品用培养法进行单增李斯特菌的菌落计数，同时将单增李斯特菌培养液样品超声破碎15分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液；依次将所取样品的上清液与浓度为0.90mgμL-1的CAT-Lipo在室温下反应1小时；通过检测CAT-Lipo中释放的邻苯二酚引起的A270变化差值计算上清液中的LLO；然后将测得的上清液中LLO浓度与对应样品的菌落数作图，建立LLO浓度与单增李斯特菌浓度线性关系曲线；(3)蛋白标志物LLO的电化学检测：将梯度浓度的LLO蛋白分别加入250μL浓度为50mM、pH7.0的磷酸盐缓冲液与50μLpH7.0的TSB混合液反应体系中，以CAT-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于李斯特菌溶血素O(LLO)的单增李斯特菌检测试纸条的制备方法，步骤是：/n(1)制备纳米多孔金(NPG)：将厚度为100±10nm的Au/Ag合金片置于浓硝酸中，在(30～50)±2℃温度下，腐蚀0.5～4小时，制得NPG薄膜；其中，所述Au/Ag合金的重量比为Au40～48:Ag52～60；/n(2)制备NPG/CWE电极：准备具有1个工作电极、一个Ag/AgCl参比电极和一个碳对电极的试纸条，其中所述工作电极选择碳工作电极(CWE)，将制备的NPG薄膜固定于试纸条的工作电极CWE上，制备获得NPG/CWE电极；/n(3)制备CAT-Lipo/NPG/CWE生物电极：将磷脂酰胆碱、胆固醇和1-十八烷硫醇按照摩尔比9-10:9-10:1-2的比例混合在氯仿中，置于小口瓶中；然后用N

【技术特征摘要】
1.一种基于李斯特菌溶血素O(LLO)的单增李斯特菌检测试纸条的制备方法，步骤是：
(1)制备纳米多孔金(NPG)：将厚度为100±10nm的Au/Ag合金片置于浓硝酸中，在(30～50)±2℃温度下，腐蚀0.5～4小时，制得NPG薄膜；其中，所述Au/Ag合金的重量比为Au40～48:Ag52～60；
(2)制备NPG/CWE电极：准备具有1个工作电极、一个Ag/AgCl参比电极和一个碳对电极的试纸条，其中所述工作电极选择碳工作电极(CWE)，将制备的NPG薄膜固定于试纸条的工作电极CWE上，制备获得NPG/CWE电极；
(3)制备CAT-Lipo/NPG/CWE生物电极：将磷脂酰胆碱、胆固醇和1-十八烷硫醇按照摩尔比9-10:9-10:1-2的比例混合在氯仿中，置于小口瓶中；然后用N2去除有机溶剂，在底部形成薄的脂质层；加入适量0.1～2.0M的邻苯二酚溶液溶解脂质层，并使脂质终浓度为0.1～9.0mgmL-1，然后在超声波清洗器中超声作用5～30分钟；再用探头式超声破碎仪以60～300W功率对溶液进行超声处理1～10分钟；之后，通过离心收集邻苯二酚-脂质体(CAT-Lipo)复合物，用50mM、pH7.0的PBS洗涤3～5次，去除游离的邻苯二酚；然后将CAT-Lipo复合物颗粒重新悬浮在50mM、pH7.0的PBS中，使其最终浓度为0.01～0.90mgμL-1；然后将1～70μL浓度为0.01～0.90mgμL-1的CAT-Lipo滴在NPG/CWE电极表面，制得CAT-Lipo/NPG/CWE生物电极。


2.根据权利要求1所述基于李斯特菌溶血素O(LLO)的单增李斯特菌检测试纸条的制备方法，其特征在于，以如下步骤完成：
(1)制备纳米多孔金(NPG)：将厚度为100±5nm的Au/Ag合金片置于浓硝酸中，在40℃±2℃温度下，腐蚀1.5±0.5小时，制得NPG薄膜；其中，所述Au/Ag合金的重量比为Au50:Ag50；
(2)制备NPG/CWE电极：准备具有1个工作电极、一个Ag/AgCl参比电极和一个碳对电极的试纸条，其中所述工作电极选择碳工作电极(CWE)，将制备的NPG薄膜固定于试纸条的工作电极CWE上，制备获得NPG/CWE电极；
(3)制备CAT-Lipo/NPG/CWE生物电极：将磷脂酰胆碱、胆固醇和1-十八烷硫醇按照摩尔比10:10:1的比例混合在氯仿中，置于小口瓶中；然后用N2去除有机溶剂，在底部形成薄的脂质层；加入适量1.5M的邻苯二酚溶液溶解脂质层，并使脂质终浓度为8.0mgmL-1，然后在超声波清洗器中超声作用30分钟；再用探头式超声破碎仪以100W功率对溶液进行超声处理10分钟；之后，通过离心收集邻苯二酚-脂质体(CAT-Lipo)复合物，用50mM、pH7.0的PBS洗涤3次，去除游离的邻苯二酚；然后将CAT-Lipo复合物颗粒重新悬浮在50mM、pH7.0的PBS中，使其最终浓度为0.90mgμL-1；然后将5～40μL浓度为0.90mgμL-1的CAT-Lipo滴在NPG/CWE电极表面，制得CAT-Lipo/NPG/CWE生物电极。


3.一种权利要求1或2所述方法制得的基于李斯特菌溶血素O(LLO)的单增李斯特菌检测试纸条。


4.权利要求3所述基于李斯特菌溶血素O(LLO)的单增李斯特菌检测试纸条在检测单增李斯特菌中应用。


5.权利要求3所述基于李斯特菌溶血素O(LLO)的单增李斯特菌检测试纸条在检测单增李斯特菌蛋白标志物LLO中的应用。


6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，利用所述基于李斯特菌溶血素O(LLO)的单增李斯特菌检测试纸条对单增李斯特菌蛋白标志物LLO检测的方法是：
(1)基于LLO的单增李斯特菌检测试纸条的表征：以权利要求1或2所述方法制得的基于李斯特菌溶血素O(LLO)的单增李斯特菌检测试纸条的CAT-Lipo/NPG/CWE生物电极为工作电极，以Ag/AgCl为参比电极，以碳电极为对电极，构建三电极检测体系；其中所述CAT-Lipo/NPG/CWE生物电极事先在0.5MH2SO4中进行循环伏安法扫描20圈，以还原峰峰电流表征CAT-Lipo/NPG/CWE生物电极的有效面积；
(2)建立蛋白标志物LLO浓度与单增李斯特菌浓度线性关系：将单增李斯特菌接种于TSB培养基中，然后放置于37℃摇床200rpm培养，并按间隔设定时间依次取样；首先依次将所取样品用培养法进行单增李斯特菌的菌落计数，同时将单增李斯特菌培养液样品超声破碎15分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液；依次将所取样品的上清液与浓度为0.90mgμL-1的CAT-...

【专利技术属性】
技术研发人员：王霞，张亚超，许平，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37