一种快速分离富集乳制品中乳铁蛋白的方法技术

一种快速分离富集乳制品中乳铁蛋白的方法属于纳米材料和分析技术领域。本发明专利技术制备了一种硼酸官能化聚合物材料用于选择性富集乳制品中乳铁蛋白,可将此材料填充于固相萃取小柱，进行样品前处理，采用液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种快速分离富集乳制品中乳铁蛋白的方法

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[0001]本专利技术属于纳米材料和分析
，具体涉及一种硼酸修饰聚合物纳米粒子的制备方法及其应用。

技术介绍
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[0002]乳铁蛋白(Lf)是一种天然蛋白质，广泛存在于动物乳汁中，是一种双叶铁结合的球状糖蛋白。因其具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等强大生物功能，欧盟已批准牛乳铁蛋白作为新型食品成分，而中国政府当局已规定乳制品中牛乳铁蛋白的浓度限值应为1.0g/kg，婴儿配方食品中的牛乳铁蛋白剂量为1.0g/L。通常采用色谱法、超滤法、盐析法和酸沉降法分离乳铁蛋白。目前,报道的乳制品中乳铁蛋白检测方法包括酶联免疫法、高效毛细管电泳法、生物传感测定法、高效液相色谱法、高效液相
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质谱联用法等。
[0003]由于牛奶基质的复杂性，与其他蛋白质和脂肪相比，乳铁蛋白浓度较低，对其的检测存在一定困难。目前，通常用肝素亲和柱对牛奶中的乳铁蛋白进行萃取，但是肝素亲和柱价格昂贵，且不能多次循环利用，存在一定局限性。
[0004]聚合物纳米材料是单体和交联剂在自由基反应引发剂引发下反应形成交联的骨架结构的一种多孔材料。通过选择特定的单体和交联剂种类，在合适的用料比例下，形成的具有亲水性强、比表面积大、均匀的孔径，良好的稳定性，表面易于修饰等优点的一种纳米材料。由于其制备简单，价格低廉，在材料修饰和分析检测等领域都得到了广泛的关注。
[0005]因此，本专利技术将硼酸亲和与聚合物材料相结合，设计了一种氨基化的聚合物纳米粒子并在表面接枝苯硼酸，基于硼酸与顺式邻二羟基之间的亲和作用，将其用于糖蛋白的分离富集。该方法对乳制品中的乳铁蛋白有较好的分离富集效果。

技术实现思路
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[0006]本专利技术的目的在于提供一种亲水性的硼酸功能化聚合物材料。
[0007]本专利技术的目的在于提供所述亲水性硼酸功能化聚合物材料的制备方法。
[0008]为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种亲水性的硼酸功能化聚合物材料，其特征在于该纳米粒子由内至外依次是聚合物内核、连接层和苯硼酸外层，层与层之间通过化学键键合。具体步骤如下：(1)将单体甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA,甲基丙烯酸甲酯MMA,苯乙烯ST和交联剂二乙二醇二甲基丙烯酸酯DEGDMA混合，加入致孔剂甲苯，正己烷，正癸醇超声。在混合物中加入偶氮二异丁腈AIBN引发剂超声。用氮气吹扫后反应一定时间。反应结束后，将材料冷却至室温，研磨成粉末，用甲醇洗涤，将所得产物真空干燥。其中，所述单体甲基丙烯酸缩水甘油酯，甲基丙烯酸甲酯和苯乙烯的质量比为3:3:2，致孔剂甲苯，正己烷和正癸醇的质量比为3:3:2，单体与致孔剂的体积比为1:5，交联剂二乙二醇二甲基丙烯酸酯与致孔剂的质量比为1.18:1，加入的偶氮二异丁腈质量为单体质量的1％。超声时间为5
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15min，反应温度为60℃
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90℃，反应时间为4
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8h。
(2)将聚合物材料加入到聚乙烯亚胺的甲醇溶液中，在一定温度下进行磁力搅拌。其中，所述聚合物和聚乙烯亚胺的质量比为1:5，聚乙烯亚胺在甲醇溶液中的浓度为100mg/mL。所述反应温度为65℃，反应时间为5
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12h。(3)将GMA
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MMA
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DEGDMA@PEI纳米颗粒分散在甲醇/乙酸溶液中，先后加入与GMA
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MMA
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DEGDMA@PEI纳米粒子材料质量1
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1.2倍的4
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甲酰基苯硼酸和氰基硼氢化钠，在30
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50℃条件下反应8
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12个小时。用水和乙醇依次洗涤2
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3次并干燥，得到最终产物。其中，甲醇与乙酸的体积比为148.8:1.2，加入的GMA
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MMA
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DEGDMA@PEI纳米粒子在甲醇/乙酸混合溶液中的浓度为0.67mg/mL。
[0009]本专利技术另一目的是将上述合成的硼酸功能化聚合物纳米材料用于乳制品中乳铁蛋白的分离与富集，并提供一种乳制品中乳铁蛋白的检测方法。
[0010]作为本专利技术进一步的方案：所述样品为牛奶，牛奶样品中乳铁蛋白的萃取方法为：将10mL牛奶样品在9000r下离心20min得到脱脂奶。用pH＝7
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9的缓冲液将脱脂奶稀释，将2
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10mg纳米颗粒加入到含有5
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30μg/mL乳铁蛋白的脱脂奶中并振荡，离心，弃去上清液，依次加入pH＝7
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9的缓冲液和水洗涤3次。离心后弃去上清液，加入pH＝1.5
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3的甲酸水溶液并振荡以洗脱结合的乳铁蛋白，离心，过0.22μm聚醚砜滤膜，滤液上机测试。样品检测的超高效液相色谱
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紫外检测器条件为：色谱柱为Waters Acquity Protein BEH C4，规格(2.1mm
×
100mm，1.7μm)，流动相A为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为含0.075％甲酸的乙腈和水溶液(71.4:28.6v/v)，柱温为30℃，流速为0.3mL/min，样品进样量为2μL，洗脱方式为梯度洗脱，检测波长为205nm。梯度洗脱程序如下：0
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5.5min，28
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100％B；5.5
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8min，100％B；8
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8.2min，100
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28％B；8.2
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9min，28％B。
[0011]本专利技术的有益效果是：(1)使用的单体和交联剂为不含苯环的甲基丙烯酸缩水甘油酯,甲基丙烯酸甲酯和二乙二醇二甲基丙烯酸酯，提高了材料的亲水性，有利于乳铁蛋白的吸附。(2)该高分子材料中聚乙烯亚胺含有多个氨基可结合多个硼酸位点从而提高糖蛋白的富集能力。(3)聚合物纳米材料具有较大的比表面积，均匀的孔径，良好的化学稳定性，且生产成本低，制备简单。(4)本专利技术考虑到吸附和解吸附效果会随着时间的延长而提升的效果以及考虑到时间成本，考察了10
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60min不同时间的吸附和解吸附效果，在40min内可得到较好的吸附效率，在40min内可得到较好的解吸附效率，选择该吸附和解吸附时间既能得到较好的效果又节约了时间。相比于其它的硼酸功能化材料，选择该吸附材料所需时间较短。(5)本专利技术的检测方法操作简单、分析快速、结果准确，值得推广应用。
附图说明：
[0012]图1为本专利技术的亲水性硼酸功能化聚合物材料的扫描电镜图，其中：图1(a)为放大30000倍,图1(b)为放大60000倍。
[0013]图2为亲水性硼酸功能化聚合物材料的红外表征图，其中(a)为GMA
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MMA
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DEGDMA；(b)为GMA
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MMA
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DEGDMA@PEI；(c)GMA
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种硼酸功能化聚合物材料，其特征在于，所述材料的内核为聚合物纳米粒子，中间的连接层为聚乙烯亚胺，外层为苯硼酸，层与层之间通过化学键键合。2.制备如权利要求1所述的硼酸功能化聚合物材料的方法，其特征在于，具体操作步骤如下：(1)合成聚合物纳米粒子GMA
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MMA
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DEGDMA NPs：将一定量的单体甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA,甲基丙烯酸甲酯MMA,苯乙烯ST和交联剂二乙二醇二甲基丙烯酸酯DEGDMA混合，加入致孔剂甲苯，正己烷，正癸醇超声5
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15min；在混合物中加入偶氮二异丁腈AIBN作为自由基反应引发剂，超声5
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15min；用氮气吹扫后密封于60℃
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90℃反应4
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8h；反应结束后，将材料冷却至室温，研磨成粉末，用甲醇洗涤4
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6次，将所得产物真空干燥，得到GMA
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MMA
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DEGDMA NPs；(2)制备氨基化聚合物纳米粒子GMA
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MMA
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DEGDMA@PEI NPs：将聚合物添加到聚乙烯亚胺的甲醇溶液中，聚合物和聚乙烯亚胺的质量比为1:5，在65℃下磁力搅拌5
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12h；离心收集产物，用甲醇洗涤3
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6次并干燥，得到GMA
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MMA
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DEGDMA@PEI NPs；(3)制备硼酸修饰的聚合物纳米粒子GMA
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MMA
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DEGDMA@PEI
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FPBA NPs：将GMA
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MMA
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DEGDMA@PEI纳米颗粒分散在甲醇/乙酸溶液中，加入与GMA
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MMA
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DEGDMA@PEI纳米粒子材料质量1
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1.2倍的4
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甲酰基苯硼酸，加入与GMA
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MMA
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DEGDMA@PEI纳米粒子材料质量1
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1.2倍的氰基硼氢化钠，在30
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【专利技术属性】
技术研发人员：杜振霞，罗华蓉，王梦雨，张凤霞，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：