本发明专利技术涉及生物技术可再生能源领域，具体为一种自然共生的混合培养物降解粗饲料生产柠檬酸的方法，所述的混合培养物YakQH5由厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter gottschalkii)组成，于2020年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19299，所述的混合培养物YakQH5能够分别降解15种粗饲料，并产生大量柠檬酸，尤其以苜蓿为底物时，柠檬酸产量高达46.0mM，在发酵过程中添加复合抗生素，还可以防止混合培养物在发酵过程中不受细菌污染，进一步提高厌氧发酵效率，本发明专利技术所述混合培养物YakQH5具有重要的工业应用价值。业应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种自然共生的混合培养物降解粗饲料生产柠檬酸的方法
[0001]本专利技术涉及生物技术可再生能源领域，具体为一种自然共生的混合培养物降解粗饲料生产柠檬酸的方法。
技术介绍
[0002]粗饲料是指天然水分含量在60％以下，干物质中粗纤维含量等于或高于18％，并以风干物形式饲喂的饲料，如牧草、农作物秸秆、树叶、酒糟和秕壳等。粗饲料的主要成分是木质纤维素，纤维含量高，蛋白质、矿物质含低，适口性差，畜禽消化率低，从而限制了它的应用。这些粗饲料每年产生的数量非常巨大，如小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆、燕麦秸秆、大豆秸秆、黄豆秸秆、洋芋秸秆、苜蓿、麸皮、酒糟、番茄渣、小麦壳等，它们作为能源物质仍然没有得到合理开发利用。目前主要采用生物学手段，即采用能分泌高效木质纤维素降解酶类的微生物来降解和利用大量粗饲料。但目前有效提高粗饲料的木质纤维素利用率、实现木质纤维素的生物转化的微生物菌种资源却极端缺乏。如何建立高效生物转化技术、实现木质纤维素的生物转化是解决巨大粗饲料资源的根本出路。
[0003]牦牛(Bos grunniens)是生活在海拔最高处，耐粗饲、耐严寒的，能适应高寒缺氧的草食性反刍动物。青藏高原是牦牛主产区。我国牦牛饲养以放牧为主，牦牛瘤胃内栖息着大量独特的，复杂多样的微生物群落协同降解低质野牧草和冷季干枯草为牦牛提供生存能量和营养物质，使牦牛瘤胃成为高效降解木质纤维素的天然厌氧发酵罐。牦牛瘤胃内存在着自然共生的厌氧真菌和甲烷菌共培养物，它们能够分泌高活性木质纤维素降解酶降解野生牧草和干枯牧草为牦牛提供生长的营养，因此从牦牛瘤胃分离自然的厌氧真菌和甲烷菌共培养物应用于降解廉价木质纤维素底物生产乙酸和甲烷等代谢终产物在工业应用方面具有重要意义。
[0004]柠檬酸(化学名称：2
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羟基
‑
均丙三羧酸)是一种重要的有机酸，无色晶体，常含一分子结晶水。在化工和纺织业、食品业、环保业、禽畜生产业、化妆业和医药等行业具有极多的用途。1784年C.W.舍勒首先通过在水果榨汁中加石灰乳形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸。中国用发酵法制取柠檬酸以1942年汤腾汉等报告为最早。1952年陈声等开始用黑曲霉浅盘发酵制取柠檬酸。1965年进行了生产100t甜菜糖蜜原料浅盘发酵制取柠檬酸的中间试验，并于1968年投入生产。1966年后，天津市工业微生物研究所、上海市工业微生物研究所相继开展用黑曲霉进行薯干粉原料深层发酵柠檬酸的试验研究，并获得成功，从而确定了中国柠檬酸生产的这一主要工艺路线，其工艺简单，不需添加营养盐，产率高，是中国独特的先进工艺。中国石油发酵柠檬酸的研究较早。1970年，天津、上海、沈阳等地研究单位利用解脂假丝酵母进行石蜡油发酵生产柠檬酸的试验。1979年徐子渊等筛选出对氟乙酸敏感的变异株解脂假丝酵母，显著地提高了石油发酵柠檬酸的产率。目前随着高产菌株的应用和新技术的不断开拓，柠檬酸发酵和提取收率都有明显提高，柠檬酸工业发展突飞猛进。
[0005]专利技术人在攻读博士期间首次研究了放牧牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌共培养物分别以小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆为底物进行厌氧发酵(魏亚琴.牦牛瘤胃厌氧真菌与甲
烷菌共培养物的多样性及其纤维降解特性研究[D].2016.)，通过检测产气量、多糖水解酶活性、各种酯酶活性、干物质降解率、酚酸释放量、甲烷和乙酸产量来评估厌氧真菌和甲烷菌共培养物降解秸秆功效，其中厌氧真菌和甲烷菌共培养物N.frontalis Yak16+M.ruminantium，Piromyces Yak18+M.ruminantium和O.joyonii Yak7+M.ruminantium分别降解三种秸秆所产生的乙酸和甲烷的产量很高，但是柠檬酸的产量极低，所以没有在博士论文中列出柠檬酸的数据。迄今为止，国内外没有关于厌氧真菌，或者厌氧真菌和甲烷菌共培养物降解秸秆等粗饲料产生柠檬酸的报道。
技术实现思路
[0006]针对上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种自然共生的混合培养物YakQH5降解粗饲料生产柠檬酸的方法，所述的混合培养物YakQH5由厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter gottschalkii)组成，所述的方法包括如下步骤：
[0007](1)混合培养物YakQH5菌剂的制备：以10％v/v接种量向以小麦秸秆为底物的厌氧培养基中接入混合培养物YakQH5，加入复合抗生素厌氧培养即得到高活力的菌剂；
[0008](2)发酵降解粗饲料生产柠檬酸：吸取步骤(1)制备的菌剂，按10％v/v接种量分别接入以1％w/v粗饲料为底物的厌氧培养基中，同时加入1％v/v复合抗生素，培养。
[0009]优选地，所述的混合培养物YakQH5于2020年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19299，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010
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64807355。分离自青藏高原的海南州星海镇的全放牧牦牛瘤胃内容物中。
[0010]优选地，所述的步骤(1)中厌氧培养的温度为39℃，时间为72小时；所述的步骤(2)中厌氧培养的温度为39℃，时间为5天。
[0011]优选地，所述的复合抗生素为青霉素钠和硫酸链霉素，在厌氧培养基中的浓度分别为1600IU/mL和2000IU/mL。
[0012]优选地，厌氧培养基配方为：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO
3 7.0g，刃天青1.0g/L1mL，L
‑
半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000
×
g，4℃离心20min后的上清170mL，盐溶液Ⅰ82.5mL，盐溶液II 16.5mL，蒸馏水定容至1000mL。
[0013]优选地，所述的盐溶液I配制步骤如下：NaCl 6g，(NH4)2SO
4 3g，KH2PO
4 3g，CaCl2·
2H2O 0.4g，MgSO4·
2H2O 0.6g，蒸馏水定容至1000mL。
[0014]优选地，所述的盐溶液II配制步骤如下：4g K2HPO4，蒸馏水定容至1000mL。
[0015]优选地，所述的步骤(2)分别加入各种底物后除氧，充入二氧化碳，高温高压灭菌。
[0016]优选地，所述的步骤(2)加入的底物分别为小麦秸秆、胡麻秸秆、洋芋秸秆、棉花秸秆、大豆秸秆、红豆草秸秆、芦苇秆、剑麻、麸皮、瓜子壳、花生壳、小麦壳、滤纸、番茄渣和苜蓿中的一种或几种。
[0017]优选地，所述的步骤(2)加入的底物为苜蓿。
[0018]本专利技术的有益效果是：
①
本专利技术中采用的厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter gottschalkii)的混合培养物YakQH5是从牦牛瘤胃液中分离获得的，牦牛瘤胃中本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种自然共生的混合培养物YakQH5降解粗饲料生产柠檬酸的方法，其特征在于，所述的混合培养物YakQH5由厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter gottschalkii)组成，所述的方法包括如下步骤：(1)混合培养物YakQH5菌剂的制备：以10％v/v接种量向以小麦秸秆为底物的厌氧培养基中接入混合培养物YakQH5，加入复合抗生素，厌氧培养即得到高活力的菌剂；(2)发酵降解粗饲料生产柠檬酸：吸取步骤(1)制备的菌剂，按10％v/v接种量分别接入以1％w/v粗饲料为底物的厌氧培养基中，同时加入1％v/v复合抗生素，培养。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的混合培养物YakQH5于2020年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19299，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010
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64807355。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中厌氧培养的温度为39℃，时间为72小时；所述的步骤(2)中厌氧培养的温度为39℃，时间为120小时。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的复合抗生素为青霉素钠和硫酸链霉素，在厌氧培养...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏亚琴，王治业，赵疆，
申请(专利权)人：甘肃省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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