本发明专利技术公开了一种产朊假丝酵母耦合微藻培养促进谷胱甘肽合成的方法，属于微生物技术领域。本发明专利技术将产朊假丝酵母与微藻共培养，改善体系供氧平衡，从而提高谷胱甘肽的产量。通过对于培养体系溶解氧的补充与调控，从而改善了产朊假丝酵母的生长状况，使得细胞干重由88g/L提升至103.2g/L，提升了细胞的谷胱甘肽生产性能，并使得谷胱甘肽的产量由893mg/L最高可提升至1283mg/L。本发明专利技术所涉及的方法，工序简便、操作性强，可实现规模化、工业化生产。工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
一种产朊假丝酵母耦合微藻培养促进谷胱甘肽合成的方法
[0001]本专利技术涉及一种产朊假丝酵母耦合微藻培养促进谷胱甘肽合成的方法，属于微生物
技术介绍
[0002]谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合，含有巯基的三肽，具有抗氧化作用和整合解毒作用。半胱氨酸上的巯基为谷胱甘肽活性基团(故谷胱甘肽常简写为G-SH)，易与某些药物(如扑热息痛)、毒素(如自由基、碘乙酸、芥子气，铅、汞、砷等重金属)等结合，而具有整合解毒作用。
[0003]目前，本领域中通常选用产朊假丝酵母的微生物方法发酵生产谷胱甘肽，但高密度培养产朊假丝酵母(Candidautilis)合成谷胱甘肽过程时，由于菌体密度高，导致溶解氧供应不足，影响谷胱甘肽(GSH)产率。严重影响了谷胱甘肽的生产及工业化的应用。
技术实现思路
[0004]为了解决目前存在的问题，本方法通过酵母培养合成谷胱甘肽过程中，添加少量Chlorella protothecoides产生氧气，满足酵母合成谷胱甘肽时氧气供应不足的问题，显著提高菌体生长和谷胱甘肽产率。
[0005]本专利技术提供了一种合成谷胱甘肽的方法，所述方法是将产朊假丝酵母和微藻在含葡萄糖的体系中共培养，生成谷胱甘肽。
[0006]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：
[0007](1)将产朊假丝酵母和微藻分别培养，分别获得产朊假丝酵母种子液和微藻种子液；
[0008](2)将产朊假丝酵母种子液加入反应体系中进行培养，培养8-10h；
[0009](3)步骤(2)结束后，指数流加培养11-13h；
[0010](4)指数流加培养结束后，向发酵体系中添加微藻，并进行恒速流加培养20-30h。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)是将产朊假丝酵母加入种子培养基中，在150-250r/min，温度28-30℃，培养20-22h得到种子液。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)是将微藻加入种子培养基中，培养至种子液中细胞浓度为4-8g/L，
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，将产朊假丝酵母的种子液以5-15mL/100mL的量加入反应体系。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，将微藻的种子液以60-120mL/L的添加量加入反应体系。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，指数流加培养时的转速控制在350-450rpm。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)所述指数流加培养是向反应体系中添加流加培养基，流加培养基为葡萄糖400-600g/L，硫酸铵30-40g/L，磷酸二氢钾3-6g/L，硫酸镁
0.2-1g/L。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(4)所述恒速流加培养是指在反应体系中以4-6g/L/h的量加入葡萄糖。
[0018]本专利技术的优点：
[0019]本专利技术针对现有的产朊假丝酵母高密度发酵中，溶解氧供应不足、影响谷胱甘肽产量等问题，将产朊假丝酵母与微藻共培养，改善体系供氧平衡，从而提高谷胱甘肽的产量。通过对于培养体系溶解氧的补充与调控，从而改善了产朊假丝酵母的生长状况，使得细胞干重由88g/L提升至103.2g/L，提升了细胞的GSH生产性能，并使得GSH的产量由893mg/L最高可提升至1283mg/L。本专利技术所涉及的方法，工序简便、操作性强，可实现规模化、工业化生产。
具体实施方式
[0020]流加培养基(g/L)：葡萄糖500，硫酸铵36，磷酸二氢钾5，硫酸镁0.5；其中葡萄糖单独灭菌后与其它成分混合。
[0021]GSH浓度的测定：将发酵液在3000r/min下离心10min后，上清液用于培养基中营养成分的测定，沉淀的新鲜湿酵母用蒸馏水洗涤3次后，在浓度为40％(v/v)的稀乙醇溶液中振荡处理2h，温度30℃，3000r/min下离心得到的上清液中富含GSH，经稀释后用作GSH的分析检测。GSH的测定采用DTNB[5,5'-二硫双-(2-硝基苯甲酸)]-谷胱甘肽还原酶循环法。在2mL体积的石英比色皿中顺序加入100μL 6mmol/L DTNB，700μL 0.3mmol/L NADPH和200μL稀释至适当浓度的样品，室温下加入100μL 5.0U/mL谷胱甘肽还原酶启动反应，测定412nm处反应体系的起始OD值以及1.5min后的OD值，根据OD值的变化速率与GSH浓度的关系计算出样品中GSH的含量。GSH浓度对细胞干重的百分比即为胞内GSH含量。
[0022]细胞干重的测定：取25mL发酵液，经3000r/min下离心后再用蒸馏水洗涤2次，得到的湿酵母细胞在105℃下烘至恒重，计算出细胞干重(dry cell weight，DCW)。
[0023]实施例1
[0024](1)菌株：产朊假丝酵母Candidautilis，记载于梁国斌等《分批培养产朊假丝酵母合成谷胱甘肽的前体氨基酸优化策略》(公开于2017年)；
[0025](2)产朊假丝酵母培养基：
[0026]斜面培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，琼脂20，pH 6.0。
[0027]种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，pH 6.0。
[0028]发酵基本培养基(g/L)：葡萄糖15，硫酸铵5，酵母膏2，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁0.25，pH 5.5。
[0029]采用细胞高密度培养合成谷胱甘肽：
[0030]三阶段(分批培养、指数速率流加和恒速流加)细胞高密度培养策略：
[0031]分批培养时初糖(葡萄糖)浓度为15g/L，发酵9h时葡萄糖消耗完毕，后再经过12h指数速率流加，指数流加结束后进行24h恒数流加(补糖速度为5.5g/L/h)。
[0032]产朊假丝酵母种子液培养：将斜面种子在30℃活化3～4h后，取一环酵母菌体接种至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中培养，摇床转速200r/min，温度30℃，培养20～22h得到种子液。
[0033]发酵罐分批发酵培养：全自动发酵罐KFT-5L(KoBioTechco.，Ltd，韩国)中装发酵培养基2.5L，将种子液以10mL/100mL的接种量接种至发酵培养基中，搅拌转速300r/min，通气量1.2vvm，温度范围29～30℃，pH采用pH电极进行在线检测，通过自动加料泵流加3mol/L H2SO4和3mol/L NaOH溶液进行调节以维持pH变化在5.5
±
0.1以内。每隔2～3h取样一次进行检测。
[0034]流加发酵培养：流加培养包括指数和恒速流加，向发酵罐中按要求流加营养物，并提高搅拌转速至400r/min，通气量1.5vvm，温度、pH和溶氧分别采用相应的电极进行自动监测。
[0035]分批培养9h后，进行流加发酵培养，流加发酵培养包括指数和恒速流加培养，将搅拌转速调整本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，将产朊假丝酵母和微藻在含葡萄糖的体系中共培养，生成谷胱甘肽。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将产朊假丝酵母和微藻分别培养，分别获得产朊假丝酵母种子液和微藻种子液；(2)将产朊假丝酵母种子液加入反应体系中进行培养，培养8-10h；(3)步骤(2)结束后，指数流加培养11-13h；(4)指数流加培养结束后，向发酵体系中添加微藻，并进行恒速流加培养20-30h。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)是将产朊假丝酵母加入种子培养基中，在150-250r/min，温度28-30℃，培养20-22h得到种子液。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)是将微藻加入种子培养基中，培养至种子液中细胞浓度为4-8g/...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁国斌，周文鳞，林伟，印霞棐，赵文杰，李瑞海，
申请(专利权)人：江苏理工学院，
类型：发明
国别省市：
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