一种5-甲基四氢叶酸半抗原、抗原及单克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术提供一种5

【技术实现步骤摘要】
一种5
‑
甲基四氢叶酸半抗原、抗原及单克隆抗体的制备方法


[0001]本专利技术涉及单克隆抗体检测
，具体涉及一种5
‑
甲基四氢叶酸半抗原、抗原及单克隆抗体的制备方法。

技术介绍

[0002]5‑
甲基四氢叶酸，又叫活性叶酸Folate，是天然果蔬中提取的叶酸经还原、甲基化后得到的活性叶酸，5
‑
甲基四氢叶酸无需代谢，直接在小肠处被人体吸收和利用。而Folic Acid是合成叶酸，在肝脏处进行代谢。在体内须需首先转化为蝶酰多聚谷氨酸，进而转化为蝶酰多谷氨酸，然后转化为四氢叶酸，进一步转化为5,10亚甲基四氢叶酸，在体内亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）作用下，转化为5
‑
甲基四氢叶酸后，被人体吸收和利用。叶酸缺乏不仅会引起人类巨幼红细胞贫血，还与神经管畸形、肿瘤、心血管疾病等相关。传统意义上认为叶酸预防出生缺陷，并不是Folic Acid的作用，而是合成叶酸转化成5
‑
甲基四氢叶酸后发挥的作用，为人体甲基化（包括DNA合成与修复,调控基因表达等）提供甲基，参与血红蛋白合成，DNA合成与修复，达到预防出生缺陷及贫血的效果。而目前市面上针对叶酸的检测均为总叶酸，一些MTHFR基因突变导致的叶酸缺乏患者在补充大量合成叶酸后效果并不显著，而叶酸检测值却往往偏高。因此，制备一种专门针对5
‑
甲基四氢叶酸的特异性抗体用于活性叶酸检测，在临床上精准诊断叶酸缺乏症及科学指导维生素补充显得尤其重要。
[0003]目前国内外单抗制备技术已比较成熟，但针对小分子抗体制备技术一般多为多抗，多抗一般存在批间差大，动物死亡后该多抗即停产等问题。因此，建立一种杂交瘤融合筛选制备小分子单抗的技术显得尤为重要。5
‑
甲基四氢叶酸与叶酸的分子结构极为相似，仅5号位增加了一个甲基，筛选得到的单抗与叶酸有交叉反应的可能性极大。因此，开发出一种特异性针对5
‑
甲基四氢叶酸单抗，进行免疫方法的建立，对临床上叶酸相关疾病的精准诊疗很有意义。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，本申请提供一种5
‑
甲基四氢叶酸半抗原、抗原及单克隆抗体的制备方法。解决5
‑
甲基四氢叶酸在免疫测定中的原料问题，改进了5
‑
甲基四氢叶酸与叶酸存在交叉反应的问题。具体采用5
‑
甲基四氢叶酸与载体蛋白的偶联物作为免疫原和检测原，免疫BALB/c小鼠，常规细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，利用改进的方法对融合细胞所分泌的抗体进行正筛选和负筛选；经过3次克隆，获得1株可稳定分泌抗5
‑
甲基四氢叶酸的杂交瘤细胞株，该株杂交瘤细胞分泌的抗体属于IgG1亚类，相对分子质量约为150kD，抗体滴度为3.90
×
106，抗体亲和力为5.0
×
108L/mol，与叶酸等类似物没有交叉反应，而且获得的抗体能够用于5
‑
甲基四氢叶酸免疫学检测方法的建立。
[0005]为实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，一种5
‑
甲基四氢叶酸半抗原，分子式结构如式(Ⅰ)所示：
需要说明的是，5
‑
甲基四氢叶酸比叶酸多一个甲基，是天然果蔬中提取的叶酸经还原、甲基化后得到的活性叶酸，5
‑
甲基四氢叶酸无需代谢，直接在小肠处被人体吸收和利用。
[0006]进一步地，基于前述半抗原的开发，本专利技术提供一种5
‑
甲基四氢叶酸抗原的制备方法，采用5
‑
甲基四氢叶酸半抗原与载体蛋白通过重氮法偶联得到。
[0007]具体地，所述载体蛋白为牛血清蛋白、匙孔血蓝蛋白中的任意一种或多种。
[0008]具体的，5
‑
甲基四氢叶酸抗原的制备方法包括步骤：
①
将5
‑
甲基四氢叶酸溶解于HCl溶液中制备5
‑
甲基四氢叶酸半抗原溶液；
②
滴加NaNO2于所述5
‑
甲基四氢叶酸半抗原溶液中制备活化的5
‑
甲基四氢叶酸半抗原溶液；
③
用硼酸或碳酸缓冲液溶解载体蛋白，边搅拌边加入所述活化的5
‑
甲基四氢叶酸半抗原溶液，制备得所述5
‑
甲基四氢叶酸抗原。
[0009]进一步地，对于上述制备的5
‑
甲基四氢叶酸抗原，需要通过超滤离心去除未反应的物质，并置于
‑
20℃下保存备用。
[0010]根据第二方面，本专利技术提供一种5
‑
甲基四氢叶酸单克隆抗体，由本专利技术所述5
‑
甲基四氢叶酸抗原免疫BALB/c小鼠后制备得到，包括如下步骤：
①
将5
‑
甲基四氢叶酸抗原对BALB/c小鼠进行间隔免疫，以激活BALB/c小鼠腹腔内的脾细胞产生5
‑
甲基四氢叶酸抗体；
②
将所述产生5
‑
甲基四氢叶酸抗体的BALB/c小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0进行细胞融合，筛选后得到能稳定分泌5
‑
甲基四氢叶酸单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0011]③
将石蜡油注射到所述BALB/c小鼠腹腔内，10～14天后收集腹水，所述采集到的腹水用辛酸
‑
饱和硫酸铵法进行纯化,计算分子量和单抗亚类。
[0012]具体地，用5
‑
甲基四氢叶酸抗原对BALB/c小鼠进行间隔免疫，以激活所述BALB/c小鼠体内的脾细胞产生5
‑
甲基四氢叶酸抗体的步骤包括：
①
用100μg所述5
‑
甲基四氢叶酸抗原与福氏完全佐剂按照1∶1的比例混匀，分3次注射BALB/c小鼠的腹腔，每次间隔2天；
②
3周后再用100μg所述5
‑
甲基四氢叶酸抗原与福氏不完全佐剂按照1∶1的比例混匀，分3次注射BALB/c小鼠的腹腔，每次间隔2天；
③
此后每2周用50μg的5
‑
甲基四氢叶酸抗原注射BALB/c小鼠的腹腔，期间用载体竞争ELISA法测定血清效价。
[0013]具体地，载体竞争ELISA法测定血清效价包括步骤：
①
所述5
‑
甲基四氢叶酸抗原用碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，每孔100 μL包被96孔酶标板，4℃过夜，用PBST清洗3次所述96孔酶标板，每次3分钟；
②
加入载体蛋白与等量系列稀释的血清共100μL，37℃反应40分钟，洗板3次，每次3分钟；
③
加入酶标羊抗小鼠IgG，每孔100μL，37℃，30分钟，洗板3次；
④
加邻本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种5
‑
甲基四氢叶酸半抗原，其特征在于，分子式结构如式(Ⅰ)所示：。2.一种5
‑
甲基四氢叶酸抗原的制备方法，其特征在于，由权利要求1所述的5
‑
甲基四氢叶酸半抗原与载体蛋白通过重氮法偶联,得到5
‑
甲基四氢叶酸抗原。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白中的任意一种或多种。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括步骤：
①
将5
‑
甲基四氢叶酸溶解于HCl溶液中制备5
‑
甲基四氢叶酸半抗原溶液；
②
滴加NaNO2于所述5
‑
甲基四氢叶酸半抗原溶液中制备活化的5
‑
甲基四氢叶酸半抗原溶液；
③
用硼酸或碳酸缓冲液溶解载体蛋白，边搅拌边加入所述活化的5
‑
甲基四氢叶酸半抗原溶液，制备得所述5
‑
甲基四氢叶酸抗原。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述5
‑
甲基四氢叶酸抗原要用通过超滤离心去除未反应的物质，并置于
‑
20℃下保存备用。6.一种5
‑
甲基四氢叶酸抗原，其特征在于，由权利要求2
‑
5任一项所述的5
‑
甲基四氢叶酸抗原的制备方法得到。7.一种5
‑
甲基四氢叶酸单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述5
‑
甲基四氢叶酸单克隆抗体由所述权利要求6的5
‑
甲基四氢叶酸抗原免疫BALB/c小鼠后制备得到，包括以下步骤：
①
将所述5
‑
甲基四氢叶酸抗原对BALB/c小鼠进行间隔免疫，以激活所述BALB/c小鼠腹腔内的脾细胞产生5
‑
甲基四氢叶酸抗体；
②
将所述产生5
‑
甲基四氢叶酸抗体的BALB/c小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0进行细胞融合，筛选后得到能稳定分泌5
‑
甲基四氢叶酸单克隆抗体的杂交瘤细胞；
③
将石蜡油注射到所述BALB/c小鼠腹腔内，10～14d天后收集腹水，所述采集到的腹水用辛酸
‑
饱和硫酸铵法进行纯化，计算分子量和单抗亚类。8.根据权利要求7所述的5
‑
甲基四氢叶酸单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述对5

【专利技术属性】
技术研发人员：张娟，姚柚，蔡传良，王玉，刘学，陈光亮，
申请(专利权)人：深圳泰乐德医疗有限公司，
类型：发明
国别省市：