一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用。本发明专利技术自行筛选了一株聚唾液酸生产效率和产量均较高的大肠埃希氏菌，采用该菌株生产聚唾液酸时，不仅能缩短生产时间，降低生产成本，还能得到较高产量的聚唾液酸，具有很好的工业应用前景。具有很好的工业应用前景。具有很好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用


[0001]本专利技术涉及一株大肠埃希氏菌及其在产聚唾液酸中的应用，还涉及一种采用该菌种提高聚唾液酸产量的发酵工艺，属于生物发酵


技术介绍

[0002]聚唾液酸（Polysialic acid，PSA）是以N
‑
乙酰神经氨酸为单体，以α
‑
2,8和/或α
‑
2,9糖苷键连接的线性聚合物。PSA是以荚膜的形式存在于一些哺乳动物和致病性细菌细胞表面的糖蛋白和糖脂糖链末端，可用作蛋白药物的缓释材料和神经修复手术中的支架材料。
[0003]目前，生产聚唾液酸的方法只有微生物发酵法。随着近几年聚唾液酸在医药领域应用潜力的不断发现，细菌合成聚唾液酸的文献和报道逐渐增多，提高聚唾液酸的发酵水平的研究也逐步开展。报道的聚唾液酸的产量大多集中在10g/L左右，难以满足市场需求，因此提高聚唾液酸的发酵水平是高校和企业的研究方向。
[0004]此外，现阶段微生物发酵法制备聚唾液酸的发酵时间也较长，例如江苏集萃工业生物技术研究有限公司经7个批次连续发酵130h，实现聚唾液酸总产量为48.1g/L，但长时间的连续发酵增加了企业生产成本。专利CN 111733092 A提供了一种发酵法生产多聚唾液酸的方法，该方法连续发酵20h得到的聚唾液酸的产量为10g/L，单位时间发酵速度为0.5g/L
·
h。这一方法缩短了生产时间，降低了成本，但是发酵过程中有一半的时间都是通入纯氧，一方面增加了生产成本，更重要的是增加了企业生产的安全隐患。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一株大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，该菌种发酵生产聚唾液酸时，经过验证具有较快的发酵速度和较高的发酵总产量，解决了现有技术中发酵生产聚唾液酸存在的发酵水平不稳定、聚唾液酸产量低、发酵时间长的问题。
[0006]本专利技术提供了一株大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830，该菌株已于2019年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2019900。
[0007]进一步的，本专利技术菌株是从土壤中筛选得到，经过鉴定，该菌株的16Sr DNA序列如SEQ ID NO：1所示，分类命名及拉丁学名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
[0008]本专利技术还提供了上述大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830 CCTCC NO：M2019900在生产聚唾液酸中的应用，该菌株能够提高聚唾液酸的生产效率，提高聚唾液酸的总产量，具有很好的工业化应用前景。
[0009]本专利技术提供了一种生产聚唾液酸的方法，该方法以上述大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830 CCTCC NO：M2019900为菌种发酵生产聚唾液酸。
[0010]进一步的，在使用上述大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830 CCTCC NO：M2019900进行发酵生产时，所用的工艺方法和条件可以从现有技术中公开和普通使用
的工艺方法和条件中进行选择。
[0011]进一步的，本专利技术提供了一种优选的生产聚唾液酸的方法，在发酵时，将种子液接种至发酵培养基中，进行初始发酵，待糖分耗尽时，流加糖分继续发酵，直至发酵结束。
[0012]优选的，所用发酵培养基为：玉米浆干粉 8
‑
12g/L，磷酸二氢钾 5
‑
10g/L，一水葡萄糖 （单独灭菌）25
‑
35g/L，硫酸镁 0.5
‑
1.5g/L，维生素溶液（过膜除菌）0.8
‑
1.2mL/L，微量元素溶液（过膜除菌）0.8
‑
1.2mL/L，水余量。其中，维生素溶液中各成分及组成为：硫胺素 0.3
‑
0.7 g/L，泛酸钙 2.8
‑
3.6 g/L，生物素0.004
‑
0.008 g/L，水余量。微量元素溶液中各成分及组成为：FeSO4·
7H20 40
‑
60g/L，MnSO4·
H2O 6
‑
8g/L，CuSO4·
5H20 1
‑
1.5g/L，ZnSO4·
7H2O 7
‑
10g/L，水余量。
[0013]进一步的，当糖分耗尽时，发酵罐中溶氧和pH明显上升。溶氧和pH明显上升指的是，达到某一发酵时间时，溶氧和pH与前一发酵时间相比有梯度式上升，上升在5%以上。
[0014]进一步的，在发酵0
‑
20h时，控制体系pH为7
‑
7.5，发酵20h之后，控制体系pH为6.2
‑
6.5。
[0015]进一步的，整个发酵期间保持发酵温度为35
‑
37℃。
[0016]进一步的，待糖分耗尽时，以8
‑
15g/L
·
h的速率补加60
‑
75wt%的葡萄糖溶液，以流加的方式补加。从开始流加糖分时计，再发酵24
‑
27h。
[0017]进一步的，从发酵起始到流加糖分之间的初始发酵阶段，控制搅拌转速为400
‑
500rpm，通气量为1.5
‑
2vvm。待流加糖分后，调整搅拌转速和通气量保持溶氧量为发酵刚开始（即发酵起始时间）时溶氧量的20
‑
50%。
[0018]进一步的，种子液可以采用菌种活化和种子培养的方式获得，步骤为：a.将大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830 CCTCC NO：M2019900接种至一级种子培养基中，35
‑
37℃、200
‑
220rpm下培养16
‑
18h，得到一级种子培养液；b. 将一级种子培养液接种至二级种子培养基中，35
‑
37℃、200
‑
220rpm下培养6
‑
8h，得到二级种子培养液，即种子液。
[0019]进一步的，所述一级种子培养基和二级种子培养基的成分均为：胰蛋白胨 8
‑
12g/L，酵母提取物 4
‑
6g/L，氯化钠 8
‑
12g/L，水余量。
[0020]在本专利技术某一具体实施方式中，提供了一种具体的聚唾液酸生产方法，如下：（1）菌种活化取保藏的大肠埃希氏菌（保藏编号为CCTCC NO：M2019900），接种至含有50mL的一级种子培养基中，35
‑
37℃，200
‑
220rpm培养16...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830，其特征是：保藏号为CCTCC NO：M2019900。2.根据权利要求1所述的大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830，其特征是：其16Sr DNA序列如SEQ ID NO：1所示。3.权利要求1或2所述的大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830 CCTCC NO：M2019900在生产聚唾液酸中的应用。4.一种生产聚唾液酸的方法，其特征是：以权利要求1或2所述的大肠埃希氏菌(Escherichia coli) H03A2190830 CCTCC NO：M2019900为菌种发酵生产聚唾液酸。5.根据权利要求4所述的方法，其特征是：发酵时，将种子液接种至发酵培养基中，进行初始发酵，待糖分耗尽时，流加糖分继续发酵，直至发酵结束；所述发酵培养基为：玉米浆干粉 8
‑
12g/L，磷酸二氢钾 5
‑
10g/L，一水葡萄糖25
‑
35g/L，硫酸镁 0.5
‑
1.5g/L，维生素溶液0.8
‑
1.2mL/L，微量元素溶液0.8
‑
1.2mL/L，水余量；其中，维生素溶液中各成分及组成为：硫胺素 0.3
‑
0.7 g/L，泛酸钙 2.8
‑
3.6 g/L，生物素0.004
‑
0.008 g/L；微量元素溶液中各成分及组成为：FeSO4·
7H20 40
‑
60g/L，MnSO4·
H2O 6
‑
8g/L，CuSO4·
5H20 1
‑
1.5g/L，ZnSO4·
7H2O 7
‑
10g/L。6.根据权利要求5所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：张天萌，刘英杰，戚明，刘金钊，王景，
申请(专利权)人：华熙生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：