一种地顶孢霉培养物的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种地顶孢霉培养物的制备方法，包括以下步骤：S1.将地顶孢霉菌种接种于固态培养基上，培养得到一级菌种；S2.将步骤S1所得一级菌种接种于摇瓶中的种子培养基，培养得到二级种子液；S3.将步骤S2所得二级种子液接种于发酵培养基中，发酵得到三级种子液；S4.将步骤S3所得三级种子液接种于液体发酵培养基中，发酵得到发酵液；S5.将复合酶液接种于步骤S4所得发酵液中，酶解得到酶解液；S6.将保护剂加入步骤S5所得酶解液中，混合均匀得到混合液，将混合液喷雾干燥得到地顶孢霉培养物。本发明专利技术制备出的地顶孢霉培养物的得率和有效成分含量较高，应用于饲料添加剂时的效果较好。

【技术实现步骤摘要】
一种地顶孢霉培养物的制备方法
本专利技术涉及一种地顶孢霉培养物的制备方法。
技术介绍
我国是全球最大的动物饲料和畜产品生产国，饲料占全球的17.5％(世界第一)，但制约我国由生产大国向强国发展的主要瓶颈是优质、安全和生态动物饲料和畜产品的生产，而饲用抗生素的使用是当前制约这一瓶颈突破的关键。饲用抗生素的禁用已经在全球范围内成为行业和社会共识，我国已于今年正式实施饲料全面禁抗。在饲料全面禁抗的大背景下，寻找有效的替代技术成为了当务之急。以欧盟为代表的发达国家，长期开展了益生菌、酶制剂、酸化剂、植物提取物及功能性氨基酸等为核心的间接替抗综合技术研究。研究发现，地顶孢霉培养物中含有大量虫草素、虫草多糖和氨基酸等与古尼虫草相似的功能性成分，能发挥促生长、调免疫和抗应激等药理功效。近年来，地顶孢霉培养物替代抗生素作为动物饲料添加剂和免疫增强剂在家禽、家畜养殖生产中的研究与应用报道逐渐增多。地顶孢霉培养物的产业化将推动我国饲料产业从“减抗”-“替抗”-“无抗”的技术进步，为实现我国饲料的“禁抗”提供重要技术支撑。目前地顶孢霉培养物的产业化生产存在成本高、操作繁琐、有效成分得率低等问题，大大限制了其在畜牧养殖业中的应用。发酵后处理采用简单的过滤方法除去菌丝体往往会影响产品中虫草菌有效成分的含量,且发酵废水属于高浓度有机废液，含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素、糖类及多种微量元素，具有高浓度、高悬浮物、高粘度、难降解的特点，难以采用喷雾干燥等传统干燥方式进行处理以实现资源化回收利用，一般采用高温转筒造粒机制作生物复合肥，或者作为工业废水采取末端治理技术进行污水处理，甚至直接排入自然水域中，造成了严重的环境危害、资源浪费和生产成本的提高。申请号为CN201410024600.1的中国专利技术公开了一种饲料添加剂“地顶孢霉培养物”的生产方法，该生产方法通过对地顶孢霉菌种生长特性的研究，将地顶孢霉培养物生产工艺进行了改进，改进后将地顶孢霉培养物生产周期由原先的11～15天缩短至5天，主要包括“液体菌种发酵”和“固体发酵”。该专利存在的问题是其发酵后仅采用了简单的烘干、分散、过筛的处理，产物得率和有效成分含量均不高，应用于饲料添加剂时的效果不理想。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种地顶孢霉培养物的制备方法，制备出的地顶孢霉培养物的得率和有效成分含量较高，应用于饲料添加剂时的效果较好。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：一种地顶孢霉培养物的制备方法，包括以下步骤：S1.将地顶孢霉菌种接种于固态培养基上，于15-28℃培养4-6天，待菌丝长满平板并产孢即可，得到一级菌种；S2.将步骤S1所得一级菌种接种于摇瓶中的种子培养基，15-28℃、100-200转/分培养3-5天得到二级种子液；S3.将步骤S2所得二级种子液以10-30％的接种量接种于发酵培养基中，15-28℃发酵5-7天得到三级种子液，发酵过程中pH值为7-8，搅拌转速为100-200转/分，溶氧浓度为20-40％；S4.将步骤S3所得三级种子液以10-30％的接种量接种于发酵罐的液体发酵培养基中，15-28℃发酵2-3天得到发酵液，发酵过程中pH值为6-7，搅拌转速为100-150转/分，溶氧浓度为20-40％，流量为20-40cm3/h，发酵罐内压力为0.04-0.06MPa；S5.将复合酶液接种于步骤S4所得发酵液中，25-70℃、pH值为3-7条件下酶解0.5-2小时得到酶解液；S6.将保护剂加入步骤S5所得酶解液中，混合均匀得到混合液，将混合液喷雾干燥得到地顶孢霉培养物。进一步地，本专利技术所述步骤S1中，固体培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO40.2％，MgSO40.03％，CaCO30.05％，ZnSO40.01％，乙酸钠0.15％，琼脂粉2％，其余为水；固体培养基的pH值为6.5。进一步地，本专利技术所述步骤S2中，种子培养基的装液量为摇瓶体积的10-30％，种子培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO40.2％，MgSO40.03％，CaCO30.05％，ZnSO40.01％，乙酸钠0.15％，其余为水；种子培养基的pH值为6.5。进一步地，本专利技术所述步骤S3中，发酵培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO40.2％，MgSO40.03％，CaCO30.05％，ZnSO40.01％，乙酸钠0.15％，其余为水；发酵培养基的pH值为6.5。进一步地，本专利技术所述步骤S4中，液体发酵培养基的组成为蔗糖1-3％，大豆糖蜜0.5-1.5％，酵母粉1-2％，大豆蛋白胨1-2％，K2HPO40.1-0.3％，MgSO40.02-0.04％，CaCO30.04-0.06％，ZnSO40.01％，其余为水；液体发酵培养基的pH值为6.5。进一步地，本专利技术所述步骤S5中，复合酶液由β-葡聚糖酶、酸性蛋白酶、pH值为5.5的蒸馏水按照1g:1g:10mL的比例混合而成，复合酶液与发酵液的体积比为1:200。进一步地，本专利技术所述步骤S6中，保护剂的重量份组成为葡萄糖40份，水溶性淀粉55份，木瓜籽提取物5份；保护剂与酶解液的重量比为1:20，喷雾干燥时的进风温度为120-130℃，进料流量为100-120kg/小时，出风温度为55-65℃。进一步地，本专利技术所述的一种地顶孢霉培养物的制备方法，其特征在于：所述木瓜籽提取物的制备步骤为：将木瓜籽烘干后粉碎得到木瓜籽粉，将木瓜籽粉加入石油醚中超声提取45分钟得到提取液一，将提取液一离心分离10分钟得到上清液一，将上清液一旋蒸浓缩得到木瓜籽粗提物；将木瓜籽粗提物加入无水乙醇中，80℃下水浴搅拌10分钟后静置分层，取上层醇相加入氢氧化钠后80℃下水浴搅拌1小时得到提取液二，将提取液二离心分离10分钟得到上清液二，将上清液二旋蒸浓缩得到木瓜籽提取物。进一步地，本专利技术所述木瓜籽提取物的制备步骤中：木瓜籽粉与石油醚的比例为1:17g/mL，超声提取时的超声功率为200W；木瓜籽粗提物、无水乙醇、氢氧化钠的比例为50g:80mL:1g；提取液一、提取液二离心分离时的离心速度均为8000转/分。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1)本专利技术使用的液体发酵培养基的成分简单易获得，其中大豆糖蜜为大豆蛋白产品生产的废弃物，能将发酵总成本降低30％左右，应用本专利技术培养方法发酵的地顶孢霉在镜下观察时菌体有较多菌丝组成，菌丝较粗,生有成串的孢子，孢子短胖，呈卵形、长卵形至椭圆形,发酵后有特殊香味。2)本专利技术采用酶解方法对发酵液中的菌丝体进行破壁溶菌处理，促使菌丝体内的有效成分溶出，其中有效成分虫草素和虫草多糖的含量较传统的未破壁处理能提高35％左右，提高了地顶孢霉培养物的得率，且操作简单，用时较短。3)本专利技术破壁溶菌处理后无需过滤和离心处理，直接用保护剂进行喷雾干燥制得粉状的地顶孢霉培养物，酶解后直接包被的处理方式杜绝了发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种地顶孢霉培养物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：/nS1.将地顶孢霉菌种接种于固态培养基上，于15-28℃培养4-6天，待菌丝长满平板并产孢即可，得到一级菌种；/nS2.将步骤S1所得一级菌种接种于摇瓶中的种子培养基，15-28℃、100-200转/分培养3-5天得到二级种子液；/nS3.将步骤S2所得二级种子液以10-30％的接种量接种于发酵培养基中，15-28℃发酵5-7天得到三级种子液，发酵过程中pH值为7-8，搅拌转速为100-200转/分，溶氧浓度为20-40％；/nS4.将步骤S3所得三级种子液以10-30％的接种量接种于发酵罐的液体发酵培养基中，15-28℃发酵2-3天得到发酵液，发酵过程中pH值为6-7，搅拌转速为100-150转/分，溶氧浓度为20-40％，流量为20-40cm

【技术特征摘要】
1.一种地顶孢霉培养物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.将地顶孢霉菌种接种于固态培养基上，于15-28℃培养4-6天，待菌丝长满平板并产孢即可，得到一级菌种；
S2.将步骤S1所得一级菌种接种于摇瓶中的种子培养基，15-28℃、100-200转/分培养3-5天得到二级种子液；
S3.将步骤S2所得二级种子液以10-30％的接种量接种于发酵培养基中，15-28℃发酵5-7天得到三级种子液，发酵过程中pH值为7-8，搅拌转速为100-200转/分，溶氧浓度为20-40％；
S4.将步骤S3所得三级种子液以10-30％的接种量接种于发酵罐的液体发酵培养基中，15-28℃发酵2-3天得到发酵液，发酵过程中pH值为6-7，搅拌转速为100-150转/分，溶氧浓度为20-40％，流量为20-40cm3/h，发酵罐内压力为0.04-0.06MPa；
S5.将复合酶液接种于步骤S4所得发酵液中，25-70℃、pH值为3-7条件下酶解0.5-2小时得到酶解液；
S6.将保护剂加入步骤S5所得酶解液中，混合均匀得到混合液，将混合液喷雾干燥得到地顶孢霉培养物。


2.根据权利要求1所述的一种地顶孢霉培养物的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，固体培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO40.2％，MgSO40.03％，CaCO30.05％，ZnSO40.01％，乙酸钠0.15％，琼脂粉2％，其余为水；固体培养基的pH值为6.5。


3.根据权利要求1所述的一种地顶孢霉培养物的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，种子培养基的装液量为摇瓶体积的10-30％，种子培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO40.2％，MgSO40.03％，CaCO30.05％，ZnSO40.01％，乙酸钠0.15％，其余为水；种子培养基的pH值为6.5。


4.根据权利要求1所述的一种地顶孢霉培养物的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中，发酵培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO40....

【专利技术属性】
技术研发人员：江国托，刘艳，单春乔，刘秋晨，李娟，顾艳丽，刘恩，
申请(专利权)人：江苏三仪生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32