一种基于减毒李斯特菌激活的抗原提呈细胞的肿瘤免疫治疗组合物、制备方法和应用技术

一种基于修饰细胞，特别是通过减毒李斯特菌激活的抗原提呈细胞的肿瘤免疫治疗组合物、制备方法和应用。利用携带特异性抗原质粒的减毒李斯特菌来激活抗原提呈细胞，从而激活MHC抗原递呈特性和体内一系列细胞免疫反应来实现抗肿瘤治疗的目的。技术方案可特异性地激活巨噬细胞和/或树突状细胞，从而引发一系列特异性的抗肿瘤免疫反应，且操作过程无需对自体细胞进行基因改造，不受肿瘤类型限制，整体过程操作简单易行，具有可重复性，能够在体内激活一系列抗肿瘤免疫应答，极大的缩短了治疗过程，靶向性和安全性都有显著提高。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种基于减毒李斯特菌激活的抗原提呈细胞的肿瘤免疫治疗组合物、制备方法和应用
本公开主要涉及生物
具体来说，本公开提供一种基于被携带非整合抗原肽质粒的减毒李斯特菌激活的抗原提呈细胞的肿瘤免疫治疗的组合物、方法和应用。
技术介绍
近年来，随着对肿瘤的发生发展、机体抗肿瘤免疫应答、肿瘤免疫逃逸及肿瘤微环境等的深入研究和认识，肿瘤免疫治疗的新思路和新策略已得到进一步的研究和拓展，肿瘤免疫疗法受到前所未有的重视[1]。由于其在临床研究中体现出常规手术放化疗所无可比拟的优势，如对患者器官损伤小、治疗不良反应小、对残存肿瘤有效清除及明显延长生存期等，从而被认为是最有可能治疗癌症的方法，在2013年被Science杂志列为十大科学突破的首位[2]。目前，肿瘤免疫治疗主要围绕免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、肿瘤疫苗、细胞免疫治疗、小分子抑制剂等方面展开研究。目前常见的细胞免疫治疗的方法有自体肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes，TIL)、NK(Natural killer cell)细胞免疫治疗、DC-CIK、巨噬细胞活性化疗法以及CAR-T(chimeric antigen receptor T cell)等[3-7]。自体肿瘤浸润性淋巴细胞是从肿瘤部位分离出的淋巴细胞，在体外经IL-2等细胞因子刺激后扩增产生，其表型以CD4+T细胞和CD8+T细胞为主，虽然在临床上具有强大的细胞增殖能力和杀伤作用，但具有一定的肿瘤类型限制和MHC限制性，且细胞的取材受到限制，并且过程繁琐；NK细胞免疫治疗已用于黑色素瘤、肺癌等的临床研究，其与T细胞不同，在发挥抗肿瘤应答前不需要肿瘤特异性识别或扩增。但NK细胞抗肿瘤效益受肿瘤细胞表面大量受体控制，因此临床上表现低效；DC-CIK细胞治疗是利用DC(dendritic cell)和CIK(cytokine-induced killers)细胞联合来治疗肿瘤的方法，因其不受MHC等因素限制而在理论上具有广谱抗肿瘤作用，在我国被应用于多种癌症不同阶段的治疗，但这种方法在美国数十年的临床研究发现效果不佳，与此同时，前述细胞制备过程不易控制，重复性较差；巨噬细胞活化疗法是日本科学家开发的一种把人体内巨噬细胞激活的治疗方法，该方法利用GcMAF作为免疫刺激物激活巨噬细胞进而达到抗肿瘤效益，然而由于该方法缺乏肿瘤特异性而使得抗肿瘤效果不佳；CAR-T疗法是目前唯一被FDA批准的临床效果优秀的治疗方法，其原理是通过将患者自身血液收集的T细胞进行基因工程处理，从而在其表面表达能够和特异性肿瘤抗原结合的嵌合受体，同时在受体胞内段加上引起T细胞活化的信号传递区域，从而使得回输的细胞能够杀死具有相应抗原的肿瘤细胞，该疗法不受MHC限制因而在临床试验中显示出良好的靶向性、杀伤性和持久性，然而该方法目前仅适于血液癌，而在实体瘤临床研究上未出现良好效果，且该方法也存在细胞因子风暴等独特副作用亟需解决[8-10]。随着对肿瘤免疫治疗的深入研究，以增强机体产生肿瘤特异性杀伤免疫反应为基础的治疗方案中，机体是否进行有效的抗原提呈直接关系到治疗效果[11-12]。树突状细胞(Dendritic cells，DC)是目前发现功能最强的抗原提呈细胞，具有吞噬、抗原加工、抗原提呈及刺激T细胞产生特异性肿瘤免疫反应等功能[13]。因此通过体外培养病人自体DC，通过各种方式构建DC肿瘤疫苗，进而回输体内激活肿瘤特异性免疫反应，这种治疗策略成为继手术、放化疗及其他治疗手段又一新的治疗方法[9、14]。DC肿瘤疫苗的体外处理激活方式是其抗肿瘤免疫治疗的关键，其构建方法主要有以下几种：①肿瘤细胞裂解物处理产生致敏DC，即通过物理或化学手段将肿瘤细胞裂解释放肿瘤抗原，进而处理DC构建成疫苗，该方法需要大量的瘤内组织，且裂解物中成分复杂，其中包含机体正常抗原，可形成多种抗原表位，专一性不强，有诱导自身免疫性疾病风险，且临床上治疗有效性有待深入研究[15]；②DC和肿瘤细胞融合疫苗，即通过体外培养病人自体肿瘤细胞与DC融合产生杂交细胞，进而通过纯化分离回输机体，能有效诱导肿瘤特异性杀伤，但技术上融合效率不高缺乏有效分离纯化方法，难以获得足够数量、高质量的杂交细胞，影响临床疗效[16]；③抗原基因导入的DC肿瘤疫苗，即通过将肿瘤相关抗原或特异性抗原以基因转染或病毒等手段导入DC中构建肿瘤疫苗，该方法可实现抗原的有效提呈，但存在外源基因导入、基因修饰等过程，需要更多的安全性验证和过程规范化标准[17]；④肿瘤抗原多肽或蛋白处理，即通过体外合成的肿瘤特异性多肽或蛋白抗原处理DC细胞，使DC完成吞噬及抗原提呈进而激活抗肿瘤免疫效应，该方法具有良好的靶向性及有效性，且易于生存检测，但需要获得病人HLA分型、预测病人识别的多肽序列等进行有效性多肽匹配，在多靶点抗原多肽冲击DC时，DC对各个多肽的识别及有效提呈仍需论证[18]。由于现有细胞免疫治疗的方案中仍然存在以上问题，因此，需要开发一种新的肿瘤免疫治疗的组合物、方法和应用，以解决操作过程复杂，靶向性和安全性存在风险的问题。现有技术文献[1]Topalian S L,Weiner G J,Pardoll D M.Cancer immunotherapy comes of age.[J].Nature Clinical Practice Oncology,2011,2(3):115.[2]Couzinfrankel J.Breakthrough of the year 2013.Cancer immunotherapy.[J].Science,2013,342(6165):1432-3.[3]Rosenberg S A,Spiess P,Lafreniere R.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes.[J].Science,1986,233(4770):1318-1321.[4]Lanier LL.Up on the tightrope:natural killer cell activation and inhibition.[J].Nature Immunology,2008,9(5):495-502.[5]Wang Q J,Wang H,Pan K,et al.Comparative study on anti-tumor immune response of autologous cytokine-induced killer(CIK)cells,dendritic cells-CIK(DC-CIK),and semi-allogeneic DC-CIK[J].Chinese Journal of Cancer,2010,29(7):641-648.[6]Yamamoto N,Suyama H,Yamamoto N.Immunotherapy for Prostate Canc本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修饰细胞，所述修饰细胞由具有目标效应活性的细胞和重组李斯特菌进行接触后获得，所述重组李斯特菌含有：(i)重组核酸分子；或(ii)重组质粒；或(iii)重组表达载体；或所述重组李斯特菌表达：(iv)重组蛋白；其中，/n所述(i)重组核酸分子包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含融合至衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的异源性抗原，所述重组核酸分子还包含第一启动子序列；其中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽选自：如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有或部分具有如SEQ ID NO:1所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的活性的多肽；/n所述(ii)重组质粒或(iii)重组表达载体包含所述(i)重组核酸分子的序列；/n所述(iv)重组蛋白由所述(i)重组核酸分子编码，或由所述(ii)重组质粒或(iii)重组表达载体表达；/n其中，所述具有目标效应活性的细胞选自抗原提呈细胞。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180802 CN 2018108703501一种修饰细胞，所述修饰细胞由具有目标效应活性的细胞和重组李斯特菌进行接触后获得，所述重组李斯特菌含有：(i)重组核酸分子；或(ii)重组质粒；或(iii)重组表达载体；或所述重组李斯特菌表达：(iv)重组蛋白；其中，
所述(i)重组核酸分子包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含融合至衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的异源性抗原，所述重组核酸分子还包含第一启动子序列；其中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽选自：如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有或部分具有如SEQ ID NO:1所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的活性的多肽；
所述(ii)重组质粒或(iii)重组表达载体包含所述(i)重组核酸分子的序列；
所述(iv)重组蛋白由所述(i)重组核酸分子编码，或由所述(ii)重组质粒或(iii)重组表达载体表达；
其中，所述具有目标效应活性的细胞选自抗原提呈细胞。


根据权利要求1所述的修饰细胞，其特征在于，可选的，所述抗原提呈细胞为巨噬细胞，和/或树突状细胞；优选的，所述巨噬细胞为骨髓诱导的巨噬细胞；优选的，所述树突状细胞为骨髓诱导的树突状细胞。


根据权利要求1所述的修饰细胞，其特征在于，所述(i)重组核酸分子中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列与编码如SEQ ID NO：1所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列相比，具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少97％的同一性。


根据权利要求1-3任一项所述的修饰细胞，其中，所述(i)重组核酸分子中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原或非肿瘤抗原；可选的，所述非肿瘤抗原选自OVA或具有OVA功能的片段。


根据权利要求4所述的修饰细胞，其中，所述(i)重组核酸分子中，所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段选自包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；优选的，编码所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段的核苷酸包含如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。


根据权利要求1-3任一项所述的修饰细胞，其特征在于，所述(i)重组核酸分子中，还包含连接序列，所述连接序列连接编码所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的核苷酸序列和编码所述异源性抗原的核苷酸序列；可选的，所述(i)重组核酸分子中，所述连接序列包含编码如SEQ ID NO:10所示的序列的核苷酸序列；优选的，所述连接序列包含如SEQ ID NO:10所示的序列的一个、二个、或三个以上的重复。


根据权利要求6所述的修饰细胞，其中，所述(i)重组核酸分子中，和编码所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的核苷酸序列相连接的，包含所述异源性抗原的连接序列所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。


根据权利要求1-7任一项所述的修饰细胞，其中，所述(i)重组核酸分子中，所述第一启动子序列选自编码Phly基因的序列；可选的，...

【专利技术属性】
技术研发人员：代楠，关剑，赵勇刚，
申请(专利权)人：苏州若泰医药科技有限公司，上海若泰医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32