一种提高鸟苷发酵菌株产率的方法技术

本发明专利技术属于食品微生物、发酵技术领域，具体涉及一种提高鸟苷发酵菌株产率的方法。步骤顺序为确立菌种耐高温的目标温度值；选取出发菌液；出发菌液采用变温式定向培育；尤其是重复1～5次变温式定向培育，每次温度升高0.5～1.0℃，直到5L罐最高温度达菌种耐高温的目标温度值，选取24～80小时的发酵液作终段出发菌液；即选取发酵产率较高批次、发酵糖酸转化率最高时间段的发酵液作为出发菌液，利用与生产方法高度融合的培养环境，通过定向改变育种环境温度，获得菌种特性更接近野生型菌株、耐高温的高产鸟苷菌株应用于鸟苷发酵生产，菌种对变温式调控方法适应能力更强，大大提高鸟苷发酵菌株产率。

【技术实现步骤摘要】
一种提高鸟苷发酵菌株产率的方法
本专利技术属于食品微生物、发酵
，具体涉及一种提高鸟苷发酵菌株产率的方法。
技术介绍
鸟嘌呤核苷(简称：鸟苷)是生产鸟苷酸的原料，同时也是抗病毒药物三氮唑核苷和无环鸟苷的前体，鸟苷在食品、医药和化工等领域都有广泛的应用，鸟苷生产具有良好的发展前景。上世纪60年代，日本学者Zalkin等人开始对核苷酸代谢途径的调节机制进行研究，现已阐明了嘌呤代谢途径的调节机制，受到严格的反馈调控。目前提高鸟苷发酵产率的常用方法有菌种选育及方法优化。普通的菌种选育方法由于受严格的反馈调控作用，存在自然界自发突变高产鸟苷菌株的几率极低；传统的诱变方法工作量大、效率低；基因工程育种存在可能会引起生态危机、技术难度大、应用受禁止使用基因菌种的客户限制；选育单株在大生产应用中出现对方法调控适应性能差等缺点。
技术实现思路
针对上述技术缺陷，本专利技术提供一种提高鸟苷发酵菌株产率的方法。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：A：确立菌种耐高温的目标温度值：根据生产方法对菌种耐高温的最高温度值+1℃制定菌种耐高温的目标温度，在本专利技术中，确立菌种耐高温的目标温度为40～42℃；B：选取出发菌液：在以解淀粉芽孢杆菌作鸟苷生产菌的发酵生产过程中，选取发酵产率较高批次的发酵液，每隔6小时无菌抽取10～200ml不同周期的发酵液，暂存放于2～8℃冰箱，同步另外取样测定鸟苷含量、还原糖含量、发酵液体积，计算发酵糖酸转化率，选取发酵糖酸转化率最高时间段的发酵液作首次出发菌液。所述步骤B的发酵糖酸转化率计算方法为：发酵液鸟苷含量×体积÷耗糖量＝发酵糖酸转化率。C：出发菌液采用变温式定向培育：取出首次发菌液划线于固体茄瓶斜面基中，32～35℃培养20～24小时，将茄瓶斜面种用100ml生理盐水洗脱入5L发酵罐的发酵培养基中。发酵过程控制条件：温度为0小时34～35℃，12小时36～37℃，24～80小时37～42℃。24小时开始每隔6小时无菌抽取10～30ml不同周期的发酵液，暂存放于2～8℃冰箱，同步另外取样测定鸟苷含量、还原糖含量、发酵液体积，计算发酵糖酸转化率，选取24～80小时发酵液作变温式定向培育下一阶段的出发菌液。所述步骤C的固体茄瓶培养基配方为：可溶性淀粉3.0±0.5％、酵母粉1.0±0.5％、蛋白胨0.5±0.1％、琼脂2.0±0.2％，PH7.0。所述步骤C的5L发酵罐的发酵培养基配方为：葡萄糖12％、酵母粉2±0.5％、硫酸铵3.0±0.5％、磷酸二氢钾0.3±0.1％、硫酸亚铁0.002％，PH7.0。按C步骤操作，重复1～5次变温式定向培育，每次温度升高0.5～1.0℃，直到5L罐最高温度达菌种耐高温的目标温度值。选取24～80小时的发酵液作终段出发菌液。温度是影响微生物生长及代谢的关键因素之一，菌种生长最适温度并不一定是发酵的最适温度，也不等于积累代谢物的最适温度，采用变温式培养更利于提高产量。由于温度改变，可影响生物体内无数个酶反应，所以以往采用单一地提高选育种温度的方法获得的耐高温菌株，往往存在产量提不上去的大生产适用性差问题。为确立每次升温范围，进行了一系列的升温幅度试验，最终确立0.5～1.0℃最佳。采用本专利方法，所选耐高温菌株在大生产适用性明显提高，达提高产量目标。E：挑选高产鸟苷的耐高温单菌株：取步骤D选得的终段出发菌液1ml用0.85％生理盐水梯度稀释至10－8，分别取10－4、10－5、10－6、10－7、10－8稀释液涂布在固体培养基平板上，每稀释涂布5个，制得平板种。32～35℃培养36～72小时，达单株菌落直径达0.8～1.5mm。挑选单菌落分别接种于固体培养基斜面中，32～35℃培养24小时，接斜面种一环入摇瓶发酵基中，于往复式摇床7.5cm冲程、110～120rpa、37～40℃培养62～72小时，选取摇瓶发酵产率高的单菌株应用于F步骤。所述步骤E的固体培养基配方为：可溶性淀粉3.0±0.5％、酵母粉1.0±0.5％、蛋白胨0.5±0.1％、琼脂2.0±0.2％，PH7.0。所述步骤E的摇瓶发酵培养基配方为：葡萄糖12％、酵母粉2±0.5％、硫酸铵3.0±0.5％、磷酸二氢钾0.3±0.1％、硫酸亚铁0.002％，轻质碳酸钙3.0％，PH7.0。F：发酵采用变温式控制方法：取步骤E选得的高产单菌株出发，将菌种划线于固体茄瓶斜面基中，32～35℃培养20～24小时，按生产接种量要求将茄瓶斜面种用适量生理盐水洗脱入发酵罐的发酵培养基中。发酵过程控制条件：温度为0小时34～35℃，12小时36～37℃，24～80小时37～42℃。培养至达放罐要求。与现有技术相比，本专利技术的创新点在于：选取发酵产率较高批次、发酵糖酸转化率最高时间段的发酵液作为出发菌液，利用与生产方法高度融合的培养环境，通过定向改变育种环境温度，获得菌种特性更接近野生型菌株、耐高温的高产鸟苷菌株应用于鸟苷发酵生产，菌种对变温式调控方法适应能力更强，大大提高发酵菌株产率，使生产企业的生产成本大大降低，增强了企业市场竞争性。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明。以下操作中，未做详细说明的，均可按照分子生物学实验手册进行。实施例：A：确立菌种耐高温的目标温度值：根据生产方法对菌种耐高温的最高温度值+1℃制定菌种耐高温的目标温度为41℃。B：选取出发菌液：在以解淀粉芽孢杆菌作鸟苷生产菌的发酵生产过程中，选取现阶段发酵产率较高批次的发酵液，每隔6小时无菌抽取10～200ml不同周期的发酵液，暂存放于2～8℃冰箱，同步另外取样测定鸟苷含量、还原糖含量、发酵液体积，计算发酵糖酸转化率，选取发酵糖酸转化率最高时间段(42小时)的发酵液作出发菌液。所述步骤B的发酵糖酸转化率计算方法为：发酵液鸟苷含量×体积÷耗糖量＝发酵糖酸转化率。C：出发菌液采用变温式定向培育：取出发菌液划线于固体茄瓶斜面基中，33℃培养24小时，将茄瓶斜面种用100ml生理盐水洗脱入5L发酵罐的发酵培养基中。发酵过程控制条件：温度为0～12小时34℃－12～24小时36℃－24～80小时38℃。24小时开始每隔6小时无菌抽取20ml不同周期的发酵液，暂存放于2～8℃冰箱，同步另外取样测定鸟苷含量、还原糖含量、发酵液体积，计算发酵糖酸转化率，选取24～80小时发酵糖酸转化率最高时间段(54小时)的发酵液作D步骤的出发菌液。所述步骤C的固体茄瓶培养基配方为：可溶性淀粉3.0±0.5％、酵母粉1.0±0.5％、蛋白胨0.5±0.1％、琼脂2.0±0.2％，PH7.0。所述步骤C的5L发酵罐的发酵培养基配方为：葡萄糖12％、酵母粉2±0.5％、硫酸铵3.0±0.5％、磷酸二氢钾0.3±0.1％、硫酸亚铁0.002％，PH7.0。D：按C步骤操作，重复变温式定向培育，温度均升高0.5～1.0℃。取出发菌液划线于固体茄瓶斜面基中，33.5℃培养23小时，将茄瓶斜面种用100ml本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高鸟苷发酵菌株产率的方法，其步骤为：/nA：确立菌种耐高温的目标温度为40～42℃；/nB：在淀粉芽孢杆菌作鸟苷生产菌的发酵生产过程中，选取发酵糖酸转化率时间段在42小时的发酵液作为首次出发菌液；/nC：取步骤B的首次出发菌液划线于固体茄瓶斜面基中，32～35℃培养20～24小时，将茄瓶斜面种用100ml生理盐水洗脱入5L发酵罐的发酵培养基中进行发酵，选取24～80小时发酵液作变温式定向培育下一阶段的出发菌液；/nD：按C步骤操作，重复1～5次变温式定向培育，每次温度升高0.5～1.0℃，直到5L罐最高温度达菌种耐高温的目标温度值，选取24～80小时的发酵液作终段出发菌液；/nE：挑选步骤D所得的终段出发菌液1ml用0.85％生理盐水梯度稀释至10

【技术特征摘要】
1.一种提高鸟苷发酵菌株产率的方法，其步骤为：
A：确立菌种耐高温的目标温度为40～42℃；
B：在淀粉芽孢杆菌作鸟苷生产菌的发酵生产过程中，选取发酵糖酸转化率时间段在42小时的发酵液作为首次出发菌液；
C：取步骤B的首次出发菌液划线于固体茄瓶斜面基中，32～35℃培养20～24小时，将茄瓶斜面种用100ml生理盐水洗脱入5L发酵罐的发酵培养基中进行发酵，选取24～80小时发酵液作变温式定向培育下一阶段的出发菌液；
D：按C步骤操作，重复1～5次变温式定向培育，每次温度升高0.5～1.0℃，直到5L罐最高温度达菌种耐高温的目标温度值，选取24～80小时的发酵液作终段出发菌液；
E：挑选步骤D所得的终段出发菌液1ml用0.85％生理盐水梯度稀释至10－8，分别取10－4、10－5、10－6、10－7、10－8稀释液涂布在固体培养基平板上，每稀释涂布5个，制得平板种，32～35℃培养36～72小时，达单株菌落直径达0.8～1.5mm；挑选单菌落分别接种于固体培养基斜面中，摇瓶发酵得产率高的单菌株；
F：取步骤E选得的高产单菌株出发，将菌种划线于固体茄瓶斜面基中，32～35℃培养20～24小时，将茄瓶斜面种用生理盐水洗脱入发酵罐的发酵培养基中，培养至放罐参数。


2.根据权利要求1所述的提高鸟苷菌株发酵产率的方法，其特征在于：所述步骤B的发酵过程控制条件是起始温度为34～35℃，12小时温度达到36～37℃，24～80小时，温度达到37～42℃。


3.根据权利要求2所述的提高鸟苷菌株发酵产率的方法，其特征在于：所述步骤B的还包括在发酵24小时后，每隔6小时无菌抽取10～30ml不同周期的发酵液，计算发酵糖酸转化率，同步另外取样测定鸟苷含量、还原糖含量、发酵液体积的步骤。


4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆可，王海波，严盟，谢畅丰，张小兰，
申请(专利权)人：广东肇庆星湖生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44