包裹静脉注射免疫球蛋白的纳米微囊和制备方法及其在制备治疗缺血性脑卒药物中的用途技术

本发明专利技术公开了一种包裹静脉注射免疫球蛋白的纳米微囊和制备方法及其在制备治疗缺血性脑卒药物中的用途。本发明专利技术通过纳米技术使用2‑甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱作为单体和乙二醇二甲基丙烯酸二甲酯作为交联剂来封装静注人免疫球蛋白，通过原位聚合制得纳米微囊。本发明专利技术的纳米微囊能显著地靶向缺血脑区，且具有良好的生物相容性。在卒中早期，静注较低剂量的纳米微囊就可以达到缓解卒中脑区炎症对大脑的进一步损伤来减少神经功能的损伤和提高患者的预后，同时也可以减轻患者药物高剂量使用的副作用及治疗费用，具有巨大的转化前景和转化价值。

【技术实现步骤摘要】
包裹静脉注射免疫球蛋白的纳米微囊和制备方法及其在制备治疗缺血性脑卒药物中的用途
本专利技术涉及生物
，具体是一种包裹静脉注射免疫球蛋白的纳米微囊和制备方法及其在制备治疗缺血性脑卒药物中的用途。
技术介绍
中风是全球第二大最常见的死亡原因，并且已成为永久性残疾的主要来源。缺血性中风占所有中风的80-90％，可能导致致死性的脑损伤和严重的神经功能缺损。在缺血性中风中，血管区域脑血供的突然停止产生了一个缺血核心，周围是一个灌注不足但仍可能被挽救的区域称为缺血半暗带。缺血性损伤后数分钟，神经细胞的死亡会促发炎症反应，其特征在于局灶性神经胶质细胞的活化，周围免疫细胞的浸润以及细胞因子和趋化因子的释放，从而进一步损害脑实质和脉管系统。在缺血性中风中，补体成分3(C3)对于补体级联和免疫识别至关重要。目前，各种临床试验和实验研究表明，脑缺血后的炎症在中风发病机理中起着关键作用。此外，调节免疫力试图维持免疫稳态并促进炎症消退，这可以减少神经功能缺损并改善卒中预后。尽管已显示各种免疫调节剂是在越来越多的疾病中具有有效抗炎和免疫调节的作用，但由于无法充分穿越血脑屏障(BBB)和药物的组织脱靶效应(off-targeteffects)，如何充分利用其治疗缺血性卒中的能力仍然存在挑战。科学的进步不断提供潜在的新型免疫调节剂。例如，已经开发出抗细胞因子疗法，以在炎症反应过程中中和炎症相关的细胞因子，例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)。但是，这些疗法的脱靶作用可能导致不良反应，包括不良的毒性和中风后常见的并发症之对感染的易感性。免疫球蛋白是免疫系统细胞产生的糖蛋白，通过与病原体结合或形成封装来保护机体免受病原体的侵害。来自人血浆的纯化的多克隆免疫球蛋白G(>98％的人类免疫球蛋白G(IgG))，即所谓的静脉注射免疫球蛋白或IVIg，已获得美国食品药品管理局的批准，可高剂量用于治疗各种炎症和自身免疫性疾病，例如如川崎病，免疫性血小板减少，体液免疫缺陷和骨髓移植。此外，在高剂量下，IVIg通过直接靶向免疫系统以及神经元细胞，在治疗缺血性中风方面显示出了巨大潜力。但是，与低剂量组相比，高剂量组患者更容易发生血栓栓塞事件和皮肤反应等问题。
技术实现思路
本专利技术就是为了解决上述问题，提供了一种包裹静脉注射免疫球蛋白的纳米微囊和制备方法及其在制备治疗缺血性脑卒药物中的用途。本专利技术是按照以下技术方案实施的。一种包裹静脉注射免疫球蛋白的纳米微囊,所述纳米微囊包括静脉注射免疫球蛋白、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱和交联剂，所述静脉注射免疫球蛋白、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱和交联剂的摩尔比为1：(100-10000)：(300-30000)：(50-5000)。优选的，所述静脉注射免疫球蛋白、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱和交联剂的摩尔比为1：1000：3000：500。进一步的，所述交联剂采用乙二醇二甲基丙烯酸甲酯。一种上述包裹静脉注射免疫球蛋白的纳米微囊的制备方法，包括以下步骤：a.称取规定量的静脉注射免疫球蛋白、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱和交联剂以及过硫酸铵和N，N，N'，N'-四甲基乙二胺，在4℃下反应2小时；b.将步骤a获得的溶液用PBS缓冲液透析，去除未反应的单体和副产物；c.将步骤b透析后获得的溶液通过疏水相互作用柱(Phenyl-SepharoseCL-4B)，去除任何未包封的蛋白质，得到包裹静脉注射免疫球蛋白的纳米微囊，MPC-n(IVIg)。进一步的，步骤a中，过硫酸铵和静脉注射免疫球蛋白的摩尔比为500：1。进一步的，步骤a中，N，N，N'，N'-四甲基乙二胺与过硫酸铵的质量比为2：1。进一步的，步骤b中，PBS缓冲液的pH为7.4。一种上述包裹静脉注射免疫球蛋白的纳米微囊在制备治疗缺血性脑卒药物中的用途。本专利技术取得了以下有益效果。本专利技术的包裹静脉注射免疫球蛋白的纳米微囊能显著地靶向缺血脑区，且具有良好的生物相容性。在卒中早期，静注较低剂量的MPC-n(IVIg)(是现在报道的最低有效剂量的五分之一)就可以达到缓解卒中脑区炎症对大脑的进一步损伤来减少神经功能的损伤和提高患者的预后，同时也可以减轻患者药物高剂量使用的副作用及治疗费用，具有巨大的转化前景和转化价值。附图说明图1是本专利技术实施例1的试验结果图；图2是本专利技术实施例2的试验结果图；图3是本专利技术实施例3的试验结果图；图4是本专利技术实施例4的试验结果图；图5是本专利技术实施例5的试验结果图；图6是本专利技术实施例6的试验结果图。具体实施方式以下参照附图及实施例对本专利技术进行进一步的技术说明。实施例1.MPC-n(IVIg)的合成与表征本专利技术使用N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APM)，2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)和酸性环境下可降解交联剂(EGDMA)将IVIg封装在MPC纳米微囊中。IVIg/APM/MPC/交联剂的摩尔比为1：1000：3000：500。自由基聚合是通过将过硫酸铵(APS/IVIg，500：1，n/n)和N，N，N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED/APS，2：1，w/w)加在一起而引发的，在4℃下2小时。随后，将溶液用PBS缓冲液(pH＝7.4)透析，以去除未反应的单体和副产物，然后通过疏水相互作用柱(Phenyl-SepharoseCL-4B)去除任何未包封的蛋白质。通过将5mL苯基-SepharoseCL-4B移入玻璃柱中，然后用2.5M硫酸钠预平衡来制备该柱。首先将样品与硫酸钠混合，以使硫酸钠的最终浓度达到2.5M。然后将样品加载到色谱柱上，并用2.5M硫酸钠洗脱。收集用2.5M硫酸钠的洗脱液，并使用离心过滤浓缩。然后将样品用PBS透析以除去硫酸钠，且MPC纳米微囊保存在4℃直至使用。为了将IVIg封装在纳米微囊中并制定实现其靶向缺血性半影的有效策略，使用MPC单体与EGDMA作为可降解的交联剂，通过原位聚合反应构建了对pH敏感的MPC纳米微囊(图1a–b)。EGDMA在中性pH下稳定，但在酸性环境中可降解。透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)分别显示MPC-n(IVIg)是球形和平均直径为28.61nm(图1c)。在电泳过程中，MPC-n(IVIg)被保留在分离胶上层(图1d)，表明IVIg成功地封装在MPC纳米囊中。接下来，讨论了MPC-n(IVIg)是否对酸性环境有反应，以在体外释放IVIg。将MPC-n(IVIg)在pH7.4或6.5的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中孵育。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)在37℃下不同pH条件(7.4和6.5)下从MPC纳米粒中IVIg的时程释放进行了定量(图1e)。MPC-n(IVIg)溶液在7.4的pH值下保持稳定48小时本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包裹静脉注射免疫球蛋白的纳米微囊，其特征在于：所述纳米微囊包括静脉注射免疫球蛋白、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱和交联剂，所述静脉注射免疫球蛋白、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱和交联剂的摩尔比为1：(100-10000)：(300-30000)：(50-5000)。/n

【技术特征摘要】
1.一种包裹静脉注射免疫球蛋白的纳米微囊，其特征在于：所述纳米微囊包括静脉注射免疫球蛋白、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱和交联剂，所述静脉注射免疫球蛋白、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱和交联剂的摩尔比为1：(100-10000)：(300-30000)：(50-5000)。


2.根据权利要求1所述的一种包裹静脉注射免疫球蛋白的纳米微囊,其特征在于：所述交联剂采用乙二醇二甲基丙烯酸甲酯。


3.一种权利要求1或2所述的包裹静脉注射免疫球蛋白的纳米微囊的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.称取规定量的静脉注射免疫球蛋白、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱和交联剂以及过硫酸铵和N，N，N'，N'-四甲基乙二胺，在4℃下反应2小时；
b....

【专利技术属性】
技术研发人员：康春生，原续波，金维丽，
申请(专利权)人：天津医科大学总医院，
类型：发明
国别省市：天津;12