【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用营养缺陷型可调控细胞进行基因治疗的方法和组合物相关申请的交叉引用本国际申请要求2018年5月10日提交的美国临时申请U.S.62/669,848的优先权，将所述临时申请以其整体通过引用并入本文。序列表本申请与电子格式的序列表一起提交。标题为2158_1001PCT_SL.txt的序列表文件创建于2019年5月10日，并且大小为1,970字节。电子格式序列表的信息通过引用以其整体并入本文。公开内容的领域本文的公开内容涉及具有改善的功效和安全性的基因治疗方法、组合物和试剂盒。背景已显示细胞疗法提供有前景的治疗。然而，将修饰的细胞再引入人类宿主具有风险，包括免疫反应、恶性转化、或过度产生或缺乏对转基因的控制。基因工程的一些方法能够控制人类细胞的功能，如细胞信号传导、增殖或凋亡(参见，Bonifant等人,Mol.Ther.-Oncolytics3,16011(2016)；Sockolosky等人,(2018).Science(80-.).359,1037–1042Tey,(2014)Clin.Transl.Immunol.3,e17；将其各自通过引用以其整体并入本文)，并且使控制细胞疗法的甚至严重的副作用成为可能(Bonifant等人,2016)。尽管取得了这些进步，但其它应用仍被阻碍，不能获得广泛的应用，例如将工程化的多能细胞用于再生医学(参见，Ben-David和Benvenisty,2011,Nat.Rev.Cancer11,268–277.；Lee等人,2013,Nat.M...
【技术保护点】
1.供体模板，其包含：/n(a)与营养缺陷型诱导基因座的片段同源或与所述营养缺陷型诱导基因座的互补物同源的一个或多个核苷酸序列，和/n(b)编码治疗因子的转基因，其任选地与表达控制序列连接。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180510 US 62/669,8481.供体模板，其包含：
(a)与营养缺陷型诱导基因座的片段同源或与所述营养缺陷型诱导基因座的互补物同源的一个或多个核苷酸序列，和
(b)编码治疗因子的转基因，其任选地与表达控制序列连接。
2.如权利要求1所述的供体模板，其是单链的。
3.如权利要求1所述的供体模板，其是双链的。
4.如权利要求1所述的供体模板，其是质粒或DNA片段或载体。
5.如权利要求4所述的供体模板，其是质粒，所述质粒包含复制必需的元件，任选地包含启动子和3’UTR。
6.载体，其包含：
(a)与营养缺陷型诱导基因座的片段同源或与所述营养缺陷型诱导基因座的互补物同源的一个或多个核苷酸序列，和
(b)编码治疗因子的转基因。
7.如权利要求6所述的载体，其是病毒载体。
8.如权利要求7所述的病毒载体，其选自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒载体。
9.如权利要求7所述的病毒载体，其还包含所述病毒载体复制必需的基因。
10.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述转基因在两侧连接有与所述营养缺陷型诱导基因座的片段或其互补物同源的核苷酸序列。
11.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述营养缺陷型诱导基因座是编码参与营养缺陷型因子的合成、再循环或补救的蛋白的基因。
12.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述营养缺陷型诱导基因座在表1中的基因内或在控制表1中基因表达的区域内。
13.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述营养缺陷型诱导基因座在编码尿苷单磷酸合成酶的基因内。
14.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述营养缺陷型诱导基因座在编码全羧化酶合成酶的基因内。
15.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中与所述营养缺陷型诱导基因座的片段同源的核苷酸序列与所述营养缺陷型诱导基因座的至少200个连续的核苷酸是98％相同的。
16.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中与所述营养缺陷型诱导基因座的片段同源的核苷酸序列与人类尿苷单磷酸合成酶或全羧化酶合成酶或者表1中所述基因的任一种的至少200个连续的核苷酸是98％相同的。
17.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其还包含与所述转基因可操作连接的表达控制序列。
18.如权利要求17所述的供体模板或载体，其中所述表达控制序列是组织特异性表达控制序列。
19.如权利要求17所述的供体模板或载体，其中所述表达控制序列是启动子或增强子。
20.如权利要求17所述的供体模板或载体，其中所述表达控制序列是诱导型启动子。
21.如权利要求17所述的供体模板或载体，其中所述表达控制序列是组成型启动子。
22.如权利要求17所述的供体模板或载体，其中所述表达控制序列是转录后调控序列。
23.如权利要求17所述的供体模板或载体，其中所述表达控制序列是微小RNA。
24.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其还包含标志物基因。
25.如权利要求24所述的供体模板或载体，其中所述标志物基因包含NGFR或EGFR的至少一个片段、CD20或CD19的至少一个片段、Myc、HA、FLAG、GFP、或抗生素抗性基因。
26.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述转基因选自激素、细胞因子、趋化因子、干扰素、白介素、白介素结合蛋白、酶、抗体、Fc融合蛋白、生长因子、转录因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白、受体、细胞表面抗原、受体拮抗剂、以及共刺激因子、结构蛋白、细胞表面抗原、离子通道、表观遗传修饰剂或RNA编辑蛋白。
27.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述转基因编码T细胞抗原受体。
28.如前述权利要求中任一项所述的供体模板或载体，其中所述转基因编码RNA，任选地调控性微小RNA。
29.用于靶向整合转基因至营养缺陷型诱导基因座的核酸酶系统，其包含：
(a)cas9蛋白，和
(b)对营养缺陷型诱导基因座具有特异性的向导RNA。
30.用于靶向整合转基因至营养缺陷型诱导基因座的核酸酶系统，其包含对所述营养缺陷型诱导基因座具有特异性的兆核酸酶。
31.如权利要求27所述的核酸酶系统，其中所述兆核酸酶是ZFN或TALEN。
32.如权利要求29-31中任一项所述的核酸酶系统，其还包含权利要求1-28中任一项所述的供体模板或载体。
33.离体的修饰的宿主细胞，其包含：编码在营养缺陷型诱导基因座处整合的治疗因子的转基因，其中所述修饰的宿主细胞针对营养缺陷型因子是营养缺陷型的并且能够表达所述治疗因子。
34.如权利要求33所述的修饰的宿主细胞，其是乳动物细胞
35.如权利要求33所述的修饰的宿主细胞，其是人类细胞。
36.如权利要求33所述的修饰的宿主细胞,其中所述修饰的宿主细胞选自：胚胎干细胞、干细胞、祖细胞、多能干细胞、诱导型多能干(iPS)细胞、成体干细胞、分化细胞、间充质干细胞、神经干细胞、造血干细胞或造血祖细胞、脂肪干细胞、角化细胞、骨骼干细胞、肌肉干细胞、成纤维细胞、NK细胞、B细胞、T细胞和外周血单核细胞(PBMC)。
37.如权利要求33所述的修饰的宿主细胞，其来源于待用所述修饰的宿主细胞治疗的对象的细胞。
38.产生修饰的哺乳动物宿主细胞的方法，其包括：将(a)靶向并切割所述营养缺陷型诱导基因座处的DNA的一种或多种核酸酶系统，或者编码所述一种或多种核酸酶系统的一种或多种组分的核酸，以及(b)权利要求1-28中任一项所述的供体模板或载体引入所述哺乳动物宿主细胞。
39.如权利要求38所述的方法，其还包括引入第二核酸酶或第二向导RNA以靶向并切割第二基因组基因座处的DNA、或者引入编码所述第二核酸酶或第二向导RNA的核酸，以及任选地(b)第二供体模板或载体。
40.靶向整合转基因至离体哺乳动物细胞中营养缺陷型诱导基因座的方法，其包括：使所述哺乳动物细胞与权利要求1-28中任一项所述的供体模板或载体，以及核酸酶接触。
41.如权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是ZFN。
42.如权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是TALEN。
43.产生修饰的哺乳动物宿主细胞的方法，其包括：将以下物质引入所述哺乳动物宿主细胞中：(a)Cas9多肽或编码所述Cas9多肽的核酸，(b)对营养缺陷型诱导基因座具有特异性的向导RNA或编码所述向导RNA的核酸，和(c)权利要求1-28中任一项所述的供体模板或载体。
44.如权利要求42所述的方法，其还包括将以下物质引入所述哺乳动物宿主细胞中：(a)对第二营养缺陷型诱导基因座具有特异性的第二向导RNA或编码所述向导RNA的核酸，以及任选地(b)第二供体模板或载体。
45.靶向整合转基因至离体哺乳动物细胞中营养缺陷型诱导基因座的方法，其包括：使所述哺乳动物细胞与权利要求1-28中任一项所述的供体模板或载体、cas9多肽和向导RNA接触。
46.如权利要求43-45中任一项所述的方法，其中所述向导RNA是嵌合RNA。
47.如权利要求43-45中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包含两个杂交的RNA。
48.如权利要求38-45中任一项所述的方法，其还包括在所述营养缺陷型诱导基因座内产生一个或多个单链断裂。
49.如权利要求38-45中任一项所述的方法，其还包括在所述营养缺陷型诱导基因座内产生双链断裂。
50.如权利要求38-49中任一项所述的方法，其中使用所述供体模板或载体通过同源重组来修饰所述营养缺陷型诱导基因座。
51.如权利要求38-49中任一项所述的方法，其中在扩增所述细胞以及任选地培养所述细胞之前或之后进行步骤(a)和(b)。
52.如权利要求51所述的方法，其还包括(c)选择含有整合至...
【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯·帕特森，马修·波蒂厄斯，沃克·维伯京，
申请(专利权)人：奥克索利提克有限公司，莱兰斯坦福初级大学评议会，
类型：发明
国别省市：英国;GB
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