用于生产有机酸的微生物细胞系的分离制造技术

适合用于有机酸的工业规模生产的微生物细胞系以及制造和分离这种细胞系的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产有机酸的微生物细胞系的分离优先权声明本专利技术要求于2018年6月18日提交的美国专利申请号62/686,463的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
本公开整体上涉及过量生产有机酸的微生物细胞系及其制造方法。
技术介绍
有机酸是指具有酸性的含碳化合物。有机酸的实例包括乙酸、柠檬酸、葡糖酸、乳酸、丙酸等。由于它们是可完全降解的，有机酸可以被用在可生物降解聚合物的生产中。它们也具有其他重要的工业应用，包括作为食品添加剂。
技术实现思路
本公开提供了适合用于有机酸的工业规模生产的微生物细胞系以及制造和分离这种细胞系的方法。在一个方面，提供了制造和分离微生物细胞系的方法，其中与亲代微生物细胞系相比，所分离的微生物细胞系过量生产有机酸。所述方法使用了在增补有有机酸的pH受控的培养基中，优选在非固定培养中亲代菌株的连续传代，其中pH值被控制在高于所述有机酸的pKa值。在一些实施方式中，所述pH优选在约5.5和约7.5之间的范围内，更优选为中性或接近中性，在约6.0和约7.0之间，并且最优选为约7.0。在一些实施方式中，所述培养基是固化的。在一些实施方式中，所述培养基增补有足以抑制正常微生物细胞生长的量的有机酸，例如以降低倍增速率或生长速率，例如，将倍增速率或生长速率降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多。在一些实施方式中，在连续传代的连续迭代中以逐渐增加的量增补所述有机酸。在一些实施方式中，在连续传代的连续迭代中以相同的量增补所述有机酸。在一些实施方式中，所述有机酸是丙酸、乳酸、乙酸或丁酸。在一些实施方式中，所述有机酸是丙酸，例如，所述培养基增补有约1.0％-3.0％的丙酸，例如，约3.0％的丙酸。在一些实施方式中，所述亲代细胞系是野生型生物。在一些实施方式中，所述亲代细胞系是来源于单细胞微生物的微生物细胞系。在另一方面，提供了过量生产有机酸的微生物细胞系，其中在增补有有机酸的pH受控的培养基中使用连续传代来制造和分离所述微生物细胞系，其中pH值被控制在高于所述有机酸的pKa值，优选在约5.5和约7.5之间的范围内，更优选为中性或接近中性，在约6.0和约7.0之间，并且最优选为约7.0。在另一方面，提供了过量生产有机酸的微生物细胞系，其中所述微生物细胞系具有直接或间接地主要改变细胞包膜的结构、组成和/或功能的突变。优选地，所述微生物细胞系包含表3中鉴定的至少2种基因组突变或类似突变。更优选地，所述微生物细胞系包含表3中鉴定的所有基因组突变或同源突变。在一个实施方式中，所述微生物细胞系在表3中鉴定的至少2个基因中包含突变或与其类似的突变。在另一个实施方式中，所述微生物细胞系在表3中鉴定的所有基因或其同源物(例如，在本文所述的另一菌种中的同源基因)中包含突变。在另一个实施方式中，所述微生物细胞系在含O抗原连接酶结构域蛋白中包含突变。在另一个实施方式中，所述微生物细胞系在M18家族氨肽酶中包含突变。在另一个实施方式中，所述微生物细胞系在氨基酸通透酶中包含突变。在另一个实施方式中，所述微生物细胞系在腺嘌呤糖基化酶中包含突变。所述微生物可以是任何生产有机酸的微生物。在一个实施方式中，所述微生物来自丙酸杆菌属(Propionibacterium)(Acidipropionibacterium)，并且更优选为产丙酸丙酸杆菌(P.acidipropionici)菌种。在另一个实施方式中，所述微生物来自乳酸杆菌属(Lactobacillus)，并且更优选为嗜酸性乳酸杆菌(L.acidophilus)菌种。在另一个实施方式中，所述微生物来自醋杆菌属(Acetobacter)。在另一个实施方式中，所述微生物来自葡糖杆菌属(Gluconobacter)。在另一个实施方式中，所述微生物来自梭菌属(Clostridium)，并且更优选为丁酸梭菌(C.butyricum)菌种。在一些实施方式中，所述有机酸是丙酸。在一些实施方式中，所述有机酸是乳酸。在一些实施方式中，所述有机酸是乙酸。在一些实施方式中，所述有机酸是丁酸。本文还提供了使用本文所述的方法和微生物生产有机酸的方法。附图说明图1显示了在添加或不添加1.0％PA的固体缓冲培养基上野生型和突变体产丙酸丙酸杆菌的生长，显示了菌株3-1的表型。图2显示了与野生型相比，产丙酸丙酸杆菌的突变体菌株(菌株3-1)在生物反应器中利用漂白的AmericanBeauty蛋糕面粉(WFM作为丸剂)的PA生产。1:200接种，1L工作培养物，5％(w/v)葡萄糖当量WFM，30℃，pH7(NaOH，5M)。具体实施方式最常见的有机酸是羧酸，其酸度与羧基(-COOH)有关。它们通常是pKa值在约4-5之间的弱酸。例如，丙酸(“PA”)是化学式为C2H5COOH或C3H6O2的羧酸。它是无色、油状和刺激性(想象瑞士乳酪和汗液)液体并且其物理性质介于较小的羧酸(甲酸和乙酸)和较大的脂肪酸之间。它的分子量为约74.1g/mol，并且其pKa为约4.9，这意味着在pH为约4.9的溶液中，PA的一半处于质子化(或未解离)、不带电的状态(C2H5COOH)，而另一半处于去质子化(或解离)、带负电的状态(C2H5COO-)，后者称为丙酸化物或丙酸化物离子，其可以形成盐或酯化合物。随着pH降低(变得更加酸性)，更多PA处于质子化、不带电的状态；当pH增加(变得更加碱性)时，更多PA处于去质子化、带负电的状态。由于PA在0.1和1％(w/v)之间的水平下抑制霉菌和一些细菌的生长，PA及其盐在动物饲料和人类食品(例如烘焙物)中都被用作防腐剂。在美国，PA在用作食品添加剂时被食品药品监督管理局“一般公认为安全”或GRAS。在澳大利亚、新西兰和欧盟，它也被批准用作食品添加剂。此外，PA是其他化学品合成中的重要中间体，所述其他化学品例如纤维素来源的塑料、杀虫剂、水果调味剂、香水原料和药品。尽管它们在自然界中广泛分布，但有机酸的商业生产通常依赖于化学合成，因为这在经济上更具竞争力。例如，目前，PA几乎完全是通过石化过程商业生产的。随着原油和石化产品价格的上涨，以及生物
的快速发展，通过化学合成和通过微生物发酵制造PA的成本之间的经济差距正在缩小。伴随着对能源短缺和环境污染的日益关注，人们对从可再生资源以商业规模生物合成有机酸(如PA)越来越感兴趣。通过发酵进行有机酸的微生物生产是已知的并且已经使用了几个世纪。例如，黑曲霉(Aspergillusniger)和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)已用于生产柠檬酸；乳酸杆菌已用于生产乳酸；梭菌已用于生产乙酸；黑曲霉和葡糖杆菌已用于生产葡糖酸。丙酸杆菌是最常用于生产PA(以及维生素B12和瑞士奶酪)的微生物。丙酸杆菌是一种革兰氏阳性、无运动性、无孢子形成的杆状厌氧细菌属，其包括以下菌种：费氏丙酸杆菌(P.freudenreichii)、产酸丙酸杆菌(P.acidifaciens)、环己酸丙酸杆菌(P.cyclohexanicum)、澳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制造和分离生产有机酸的微生物细胞系的方法，所述方法包括亲代细胞系在非固定培养中在增补有足以抑制正常微生物细胞生长的量的有机酸的培养基中的连续传代，其中所述培养基的pH值被控制在高于所述有机酸的pKa值，并且其中与所述亲代细胞系相比，所分离的微生物细胞系过量生产所述有机酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180618 US 62/686,4631.一种制造和分离生产有机酸的微生物细胞系的方法，所述方法包括亲代细胞系在非固定培养中在增补有足以抑制正常微生物细胞生长的量的有机酸的培养基中的连续传代，其中所述培养基的pH值被控制在高于所述有机酸的pKa值，并且其中与所述亲代细胞系相比，所分离的微生物细胞系过量生产所述有机酸。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基是固化的。


3.根据权利要求1所述的方法，其中在连续传代的连续迭代中以逐渐增加的量增补所述有机酸。


4.根据权利要求1所述的方法，其中在连续传代的连续迭代中以相同的量增补所述有机酸。


5.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基的pH值被控制在约5.5-7.5的范围内。


6.根据权利要求5所述的方法，其中所述培养基的pH值被控制在约6.0-7.0的范围内。


7.根据权利要求6所述的方法，其中所述培养基的pH被控制在约7.0。


8.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲代细胞系是野生型的。


9.根据权利要求1-8中的任一项所述的方法，其中所述微生物细胞系来源于单细胞微生物。


10.根据权利要求9所述的方法，其中所述微生物细胞系来源于丙酸杆菌属(Propionibacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)或梭菌属(Clos...

【专利技术属性】
技术研发人员：保罗·布卢姆，桑巴西瓦·拉奥·齐古鲁帕提，德里克·杰梅恩·怀特，
申请(专利权)人：SP配料研发有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US