一种二茂铁纳米花、电化学适配体生物传感器体系及其制备方法和应用技术

一种二茂铁纳米花、电化学适配体生物传感器体系及其制备方法和应用，属于食源性致病菌快速检测领域。本发明专利技术的二茂铁纳米花包括二茂铁、Magainin I多肽、CuSO

【技术实现步骤摘要】
一种二茂铁纳米花、电化学适配体生物传感器体系及其制备方法和应用
本专利技术属于食源性致病菌快速检测
，具体涉及一种二茂铁纳米花、电化学适配体生物传感器体系及其制备方法和应用。
技术介绍
近几年，食品安全问题得到了愈加广泛的关注，在所有食源性疾病致病因素包括微生物因素、化学物理以及有毒动植物因素中，微生物因素是最重要的致病因素，高居第一位。食源性病原菌作为一种常见的微生物，分布极为广泛，是影响食品安全最重要的因素之一。因此，开展食源性致病菌的快速检测研究势在必行。目前，用于检测和鉴定食源性致病菌的方法主要包括传统的分离鉴定检测方法、免疫学法和分子生物学检测方法。传统的培养方法如平板划线法，由于其操作繁琐、所需时间长、低灵敏度等原因，已经无法满足现代检测工作中对快速便捷检测的要求。酶联免疫法(ELISA)方法容易污染，检测灵敏度受抗原-抗体结合能力影响，且需要制备高效抗体。常用的聚合酶链式反应技术(PCR)，具有较好的灵敏性，但是PCR技术需要反复的变温加热，所需仪器复杂，对操作人员技术要求较高。随着现代食品卫生以及检测速度的发展要求，对食源性致病菌的检测手段要求操作简便、灵敏快速、适应性强，显然上述传统检测方法已经不能满足这些要求。2012年Ge等首次发现蛋白质与无机金属盐类可以自组装形成花状的有机无机杂化纳米结构，称为纳米花。研究发现，与纳米花杂化的酶同游离酶相比，杂化纳米花在酶的活性与稳定性方面表现出更加稳定优越的性能，同时作者对其形成机理作了初步探究。杂化纳米花结构一经发现，便引起了研究人员的高度关注。目前纳米花已经成功运用于多种领域，如生物传感器、生物分析、生物医药、污水处理等，但其应用范围及对象有待进一步开拓创新。因此，开发新型纳米花传感器体系，在生物监测应用等领域具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种二茂铁纳米花、电化学适配体生物传感器体系及其制备方法和应用，以解决现有食源性致病菌检测成本高、效果差的问题。本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术的一种二茂铁纳米花，其组成成份为：二茂铁、MagaininI多肽、CuSO4和磷酸盐缓冲液PBS。作为优选的实施方式，所述二茂铁的体积为10～100μL、浓度为1～5mg/mL；所述MagaininI多肽的体积为10～100μL、浓度为5～15μg/mL。本专利技术的一种二茂铁纳米花的制备方法，包括以下步骤：取离心管，依次加入10～100μL、1～5mg/mL的二茂铁和10～100μL、5～15μg/mL的MagaininI多肽悬浮于800～1500μL、10mM的磷酸盐缓冲液PBS中，该磷酸盐缓冲液PBS中含有20μL、120mM的CuSO4；经震荡混匀、常温静置孵育12～24h后，10000rpm离心3～5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的磷酸盐缓冲液PBS悬浮，4℃保存备用。采用本专利技术的一种二茂铁纳米花构建的电化学适配体生物传感器体系，包括：二茂铁纳米花、修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体和标记链霉亲和素SA的磁珠。作为优选的实施方式，所述标记链霉亲和素SA的磁珠的粒径为2.8μm，浓度为10mg/mL。采用本专利技术的一种二茂铁纳米花构建的电化学适配体生物传感器体系的制备方法，包括以下步骤：步骤一、制备二茂铁纳米花取离心管，依次加入10～100μL、1～5mg/mL的二茂铁和10～100μL、5～15μg/mL的MagaininI多肽悬浮于800～1500μL、10mM的磷酸盐缓冲液PBS中，该磷酸盐缓冲液PBS中含有20μL、120mM的CuSO4；经震荡混匀、常温静置孵育12～24h后，10000rpm离心3～5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的磷酸盐缓冲液PBS悬浮，4℃保存备用；步骤二、将修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体固定在链霉亲和素SA标记的磁珠上：将5～10μL链霉亲和素SA标记的磁珠原液置于离心管中，用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次后，加入10～20μL、0.1mg/ml的修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体，37℃孵育1h，然后用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，置于磷酸盐缓冲液PBS中混合均匀，得到终产物，4℃保存备用。采用本专利技术的一种二茂铁纳米花构建的电化学适配体生物传感器体系检测食源性致病菌的方法，包括以下步骤：步骤一、将修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体固定在标记链霉亲和素SA的磁珠上；步骤二、向其中加入待测样品及和二茂铁纳米花，室温孵育1.5h进行磁性分离，用磷酸盐缓冲液PBS清洗3次后，加入40～100μLTris-HCl重悬；步骤三、将重悬混合液滴加到丝网印刷电极上，利用差分脉冲伏安法对食源性病原菌进行定量检测。作为优选的实施方式，步骤一的具体制备过程如下：将1～10μL标记链霉亲和素SA的磁珠原液置于离心管中，用0.1～0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次后，加入5～15μL、0.1mg/ml的修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体，37℃孵育1～2h，然后用0.1～0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，置于磷酸盐缓冲液PBS中混合均匀，得到终产物，4℃保存备用。作为优选的实施方式，步骤二中，所述待测样品的体积为20～100μL；所述二茂铁纳米花的体积为10～100μL。作为优选的实施方式，步骤二中，所述磷酸盐缓冲液PBS的浓度为0.1～0.5mM(pH为7.4)，其组成成份为：0.1mMNa2HPO4和0.1mMNaH2PO4；所述Tris-HCl的组成成份为：100mMNaCl和20mMTris(pH7.4)。专利技术原理：如图1所示，本专利技术利用MagaininI多肽和二茂铁(Fc)通过一步法反应合成稳定的二茂铁纳米花。抗菌肽MagaininI作为一种多肽，具有识别细菌表面膜蛋白功能，利用这种特性，可成功识别分离食源性致病菌靶标；二茂铁可作为电催化信号标签，将其合成一种可识别食源性致病菌特性的纳米聚合物，以放大信号。本专利技术的一种二茂铁纳米花对外界条件敏感度较低，利用该二茂铁纳米花构建的电化学适配体生物传感器体系，作为电化学传感器平台，可以产生稳定的电化学信号。本专利技术中，磁珠MB通过生物素(Biotin)和链霉亲和素(SA)的高特异性识别作用将靶标抗体与磁珠牢牢结合，磁珠可特异性抓取靶标。当引入靶标沙门氏菌(S.typhimurium)后，磁珠可通过抗体的作用牢牢抓取沙门氏菌。此时，二茂铁纳米花同时与靶标沙门氏菌结合，形成稳定的三明治夹芯结构，从而发挥二茂铁电化学信号标签的功能，在电解液的作用下产生电流信号，即可用于食源性病原菌的定性及定量检测。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术通过一步法合二茂铁纳米花，操作简便，且稳定性及实用性好，抗外界条件能力强。2、本专利技术通过一步法合成的二茂铁纳米花对外界条件敏感度低，利用该二茂铁纳米花构建的电化学生物传感本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种二茂铁纳米花，其特征在于，其组成成份为：二茂铁、Magainin I多肽、CuSO

【技术特征摘要】
1.一种二茂铁纳米花，其特征在于，其组成成份为：二茂铁、MagaininI多肽、CuSO4和磷酸盐缓冲液PBS。


2.根据权利要求1所述的一种二茂铁纳米花，其特征在于，所述二茂铁的体积为10～100μL、浓度为1～5mg/mL；所述MagaininI多肽的体积为10～100μL、浓度为5～15μg/mL。


3.制备权利要求1所述的一种二茂铁纳米花的方法，其特征在于，包括以下步骤：
取离心管，依次加入10～100μL、1～5mg/mL的二茂铁和10～100μL、5～15μg/mL的MagaininI多肽悬浮于800～1500μL、10mM的磷酸盐缓冲液PBS中，该磷酸盐缓冲液PBS中含有20μL、120mM的CuSO4；经震荡混匀、常温静置孵育12～24h后，10000rpm离心3～5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的磷酸盐缓冲液PBS悬浮，4℃保存备用。


4.采用权利要求1所述的一种二茂铁纳米花构建的电化学适配体生物传感器体系，其特征在于，包括：二茂铁纳米花、修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体和标记链霉亲和素SA的磁珠。


5.根据权利要求4所述的电化学适配体生物传感器体系，其特征在于，所述标记链霉亲和素SA的磁珠的粒径为2.8μm，浓度为10mg/mL。


6.制备权利要求4所述的电化学适配体生物传感器体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备二茂铁纳米花
取离心管，依次加入10～100μL、1～5mg/mL的二茂铁和10～100μL、5～15μg/mL的MagaininI多肽悬浮于800～1500μL、10mM的磷酸盐缓冲液PBS中，该磷酸盐缓冲液PBS中含有20μL、120mM的CuSO4；经震荡混匀、常温静置孵育12～24h后，10000rpm离心3～5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的磷酸盐缓冲液PBS悬浮，4℃保存备用；
步骤二...

【专利技术属性】
技术研发人员：万家余，卜胜君，刘文森，王泽，刘秀，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22