改进生物分析测定中的电化学发光信号的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于生物分析的方法，特别是，涉及使用非局域化的发光基团的电产生化学发光或电化学发光(ECL)的免疫分析和核酸分析。

【技术实现步骤摘要】
改进生物分析测定中的电化学发光信号的方法
本专利技术涉及生物分析测定的改进，特别是采用离域发光基团的电致化学发光或电化学发光(ECL)的免疫分析和核酸分析。
技术介绍
基于生物亲和性的生物分析测定，如免疫分析和DNA探测，在很大程度上依赖于标记技术，借助于标记技术，产生信号的单元通过共价键被连接至可与测定程序中的被测物特异性结合的生物分子的某些功能基团上。在一些竞争性的分析方法中，产生信号的单元通过共价键被连接在被测物分子上后，与样本中的被测物竞争其结合伴侣。在临床电化学发光(ECL)免疫分析中作为标记分子的是一种三联吡啶钌(II)的活性酯，如美国专利5,744,367和文献(G.F.Blackburnetal.,Clin.Chem.1991,37/9,1534-1539)中披露的[4-(N-琥珀酰亚胺基-氧羰基丙基)-4′-甲基-2,2′-联吡啶]双-(2,2′-联吡啶)钌(II)二六氟磷酸盐(图1A)。在发光基团三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+经历电化学氧化和一系列与共反应剂三正丙胺(TPA)的下游化学反应后，形成发光激发态[Ru(bpy)3]2+*并发出可检测的光。一个简化了的反应系列显示在反应路径一(见J.K.LelandandM.J.Powell,J.Electrochem.Soc.1990,137,3127-3131)中。反应路径一Ru(bpy)32+-e-→Ru(bpy)33+(1)N(C3H7)3-e-→N(C3H7)3·+(2)N(C3H7)3·+-H+→H6C3·N(C3H7)2(3)Ru(bpy)33++H6C3·N(C3H7)2→Ru(bpy)32+*+P(4)Ru(bpy)32+*→Ru(bpy)32++hυ(5)ECL免疫分析涉及到抗体(在夹心法中)或被测物(在竞争法中)如何被标记，被测物如何被捕获，ECL反应如何被触发以及工作电极如何再生等诸多技术细节。以ECL夹心法免疫分析为例，在一个典型的商业ECL分析中，使用图1所示的标记分子之一，用多个[Ru(bpy)3]2+发光基团在该抗体的赖氨酸残基的ε-氨基位点处标记一个抗体(信号抗体)，而另一个抗体(捕获抗体)被生物素化。当一个临床样本与这两类抗体以及链霉亲和素包裹的磁微珠按预设的一段时间互相混合后，一种夹心结构免疫复合体就在磁微珠表面形成。然后磁微珠被带入一个电化学发光测量池(流动池)并被位于测量池下的可移动磁铁捕获在电化学工作电极表面。含三丙胺的缓冲溶液冲洗掉不需要的物质并提供一种使Ru(bpy)32+发光基团经历描述在反应路径一中的ECL反应的化学环境。在一个特定的电压下(如相对于Ag/AgCl而言1.4V)，[Ru(bpy)3]2+和三丙胺同时被氧化成为[Ru(bpy)3]3+和阳离子自由基N(C3H7)3·+(反应1和2)。后者不稳定，很快地失去一个质子成为中性自由基H6C3·N(C3H7)2。该中性自由基具有强还原能力并将[Ru(bpy)3]3+还原到其发光激发态[Ru(bpy)3]2+*(反应4)。正是[Ru(bpy)3]2+*发出波长为620nm的光后回到原始的基态[Ru(bpy)3]2+(反应5)。因此，在ECL过程中，[Ru(bpy)3]2+不被消耗掉，而是像美国专利6165708中披露的那样，经历一个氧化状态的循环变化，即，Ru(bpy)32+→Ru(bpy)33+→Ru(bpy)32+*→Ru(bpy)32+。在测量过程中，这个循环不断重复，一个长延时的ECL信号由此产生并被检测。在某一时间段(例如0.5-5秒)的全部ECL光发射的积分可以作为ECL强度的度量并与被测物的量相关联。测量结束后，磁微珠和附着其上的免疫复合体被水性液流冲走，测量池被清洗，电极表面再通过电化学过程再生使其处于下一个测试的准备状态。这些按时序进行的实验细节在美国专利5,538,687and6,599,473B1中有所披露。事实上，反应路径一只是一种可以产生ECL的反应路径。其它可能的反应路径(如以下反应路径二至四)也被提出来解释不同条件下激发态[Ru(bpy)3]2+*的形成和ECL的产生(见J.K.LelandandM.J.Powell,J.Electrochem.Soc.1990,137,3127-3131,andW.Miao,J.-P.Choi,A.J.Bard,J.Am.Chem.Soc.2002,124,14478-14485)。反应路径二Ru(bpy)32+-e-→Ru(bpy)33+(1)Ru(bpy)33++N(C3H7)3→Ru(bpy)32++N(C3H7)3·+(6)N(C3H7)3·+-H+→H6C3·N(C3H7)2(3)Ru(bpy)33++H6C3·N(C3H7)2→Ru(bpy)32+*+P(4)Ru(bpy)32+*→Ru(bpy)32++hυ(5)反应路径三Ru(bpy)32+-e-→Ru(bpy)33+(1)N(C3H7)3-e-→N(C3H7)3·+(2)N(C3H7)3·+-H+→H6C3·N(C3H7)2(3)Ru(bpy)32++H6C3·N(C3H7)2→Ru(bpy)3++P(7)Ru(bpy)3++Ru(bpy)33+→Ru(bpy)32++Ru(bpy)32+*(8)Ru(bpy)32+*→Ru(bpy)32++hυ(5)反应路径四N(C3H7)3-e-→N(C3H7)3·+(2)N(C3H7)3·+-H+→H6C3·N(C3H7)2(3)Ru(bpy)32++H6C3·N(C3H7)2→Ru(bpy)3++P(7)Ru(bpy)3++N(C3H7)3·+→Ru(bpy)32+*+N(C3H7)3(9)Ru(bpy)32+*→Ru(bpy)32++hυ(5)必须指出的是，在夹心法免疫分析中，Ru(bpy)32+发光基团是标记在抗体(所谓信号抗体)并通过抗体-抗原-抗体免疫复合体而固定在磁微珠或微孔板的固相表面的。因此，在免疫分析中，所有涉及到钌配合物即Ru(bpy)3+、Ru(bpy)32+或Ru(bpy)33+的反应都是非均相反应。无论激发态如何形成，发光是从固相表面，而不是从溶液相发出的(见美国专利6,881,589B1)。固定化或局域化限制了钌配合物与其它反应性物质(即TPA衍生的中间体)的接近。尽管基于很多其它的方法和技术有改进ECL信号的方案，如新的ECL发光基团(见美国专利6,808,939B2,WO2014203067A1,WO2014019711A1)，共反应剂(X.Liuetal,Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,421-424,WO2017153574A1)，单点多标记(美国专利申请2005/0059834A1，加拿大专利申请CA2481982A1；M.Zhouetal.,Anal.Chem.2003,75,6708-6717)等，但自ECL被用作一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测样品中被测物的方法，其特征在于，包括以下步骤：/na)将所述样品与检测试剂一起孵育以提供结合有被测物的被标记检测试剂，/n其中，所述样品中含有所述被测物，/n其中，所述检测试剂被一个或多个ECL标记物标记，其中所述ECL标记物含有至少一个式1的片段：/n

【技术特征摘要】
20191031 US 16/670,2261.一种检测样品中被测物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)将所述样品与检测试剂一起孵育以提供结合有被测物的被标记检测试剂，
其中，所述样品中含有所述被测物，
其中，所述检测试剂被一个或多个ECL标记物标记，其中所述ECL标记物含有至少一个式1的片段：



其中，R1和R2相同或不同，并且各自含有ECL发光基团，
其中，所述ECL发光基团是过渡金属配合物，并且
其中所述结合有被测物的被标记检测试剂被固定在固相上；
b)将所述结合有被测物的检测试剂与未结合被测物的检测试剂和其他未固定化的物质分开，以提供分开的结合有被测物的被标记检测试剂，其中，所述分开的结合有被测物的被标记检测试剂被固定在所述固相上；
c)使所述分开的结合有被测物的被标记检测试剂与缓冲水溶液接触，其中该缓冲水溶液包含至少一种叔胺；
d)电化学触发ECL发光基团和所述叔胺的氧化，从而释放ECL信号；和
e)检测所述ECL信号，从而检测所述被测物。


2.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：周明，
申请(专利权)人：联吡啶钌科学公司，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA