一种增加人甲状腺过氧化物酶产量的试剂和表达方法技术

本发明专利技术涉及蛋白表达技术领域，公开了一种增加人甲状腺过氧化物酶产量的试剂和表达方法，利用信号肽标记的TPO基因和分子伴侣的共表达作用，筛选出高表达，高性能的TPO，可以广泛的用于临床实验。

【技术实现步骤摘要】
一种增加人甲状腺过氧化物酶产量的试剂和表达方法
本专利技术涉及蛋白表达
，具体涉及一种增加人甲状腺过氧化物酶产量试剂和的表达方法。
技术介绍
甲状腺过氧化物酶(thyroidperoxidase，TPO)是一种含有血红素辅基的膜结合糖蛋白，整个分子分为膜内区，跨膜区和膜外区，cDNA全长3kb，跨膜区的存在使TPO在表达时难以分泌出来。自身免疫性甲状腺疾病(Autoimmunethyroiddiseases，AITD)是由T细胞介导的器官特异自身免疫性疾病，患者血清内存在多种针对甲状腺抗原的自身抗体，甲状腺过氧化物酶抗体(thyroidperoxidaseantibody，TPO-Ab)就是其中最重要的一种，普遍存在于自身免疫性甲状腺疾病中，血清中甲状腺过氧化物酶抗体水平的测定，是对自身免疫性甲状腺疾病高危人群筛查、诊断和治疗的有效手段。因此，TPO-Ab水平的检测可用于对甲减、AITD等甲状腺疾病的诊断、病程进展、用药和愈后观察；且TPO-Ab的测定还可作为Graves病、桥本甲亢等诊断和鉴别诊断的首选指标，因此表达量高、性能优良的TPO蛋白，对于制作高效、低成本的甲状腺疾病检测试剂盒的开发显得尤为重要。目前，国内外所用的抗原都来自进口，成本较高，且较难订货，现有技术多用传统杆状病毒制备重组TPO，再导入昆虫细胞中进行表达，但往往存在表达量低、折叠不充分的问题，会影响后续检测阳性率，难以用于临床检测。
技术实现思路
为了解决TPO在昆虫细胞中表达产量低、折叠不充分，影响后续检测阳性率的问题，本文介绍一种可以满足市场需求的高产量、高质量和低成本的方案。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术手段：一种增加人甲状腺过氧化物酶表达产量的试剂，包括信号肽和分子伴侣。优选地，所述信号肽包括Pepidylglycinealphaamidatingmonooxygenase(PAM，SEQIDNO：1)、DBip(SEQIDNO：2)、Melittin(SEQIDNO：3)和GP64(SEQIDNO：4)。优选地，所述分子伴侣为Bip(SEQIDNO：8)、PDI(SEQIDNO：9)、Calnexin(SEQIDNO：10)或HSP70(SEQIDNO：11)中的一种或几种。更优选地，所述分子伴侣为Calnexin。本专利技术的另一方面提供了一种增加人甲状腺过氧化物酶表达产量的方法，包括A、信号肽标记的TPO转入病毒细胞，制作TPO病毒；B、分子伴侣转入病毒细胞，制作分子伴侣病毒；C、将步骤A所述的TPO病毒和步骤B所述的分子伴侣病毒导入昆虫细胞中进行表达，得TPO蛋白。可选地，所述步骤A之前可以包括信号肽的筛选过程，即将N端添加信号肽的TPO基因构建到载体中，转入DH10bac细菌中进行蓝白班筛选和PCR验证，提取正确细胞的bacmid质粒。所述信号肽筛选之后，将正确细胞的bacmid质粒，即信号肽标记的TPO，转入病毒细胞进行TPO病毒制作。上述信号肽的筛选过程可以确保TPO蛋白顺利表达，并筛选表达量最高的信号肽进行步骤A。优选地，所述步骤B分子伴侣病毒的制作具体过程为，合成分子伴侣序列并将其构建到载体中，转入DH10bac细菌中进行蓝白班筛选和PCR验证，提取正确细胞的bacmid质粒，转入病毒细胞进行分子伴侣病毒制作。步骤A和步骤B无先后顺序，所述载体优选为pfastbac1载体，所述病毒细胞优选为SF9细胞，所述TPO病毒和所述分子伴侣病毒制作后，都需要利用qPCR进行病毒滴度定量，完成滴度测量之后，进行步骤C。优选地，所述信号肽选自：Pepidylglycinealphaamidatingmonooxygenase(PAM，SEQIDNO：1)、DBip(SEQIDNO：2)、Melittin(SEQIDNO：3)或GP64(SEQIDNO：4)中的一种或多种。优选地，所述分子伴侣为Bip(SEQIDNO：8)、PDI(SEQIDNO：9)、Calnexin(SEQIDNO：10)或HSP70(SEQIDNO：11)中的一种或几种。优选地，步骤C中所述昆虫细胞为H.five细胞步骤C中TPO病毒和分子伴侣病毒共同的表达，可以帮助TPO蛋白正确折叠同时促进分泌，以此表达出高产量、高质量的TPO蛋白，满足下游检测的原料需求。优选地，还包括步骤D，所述步骤D包括将步骤C中表达得到的TPO蛋白进行纯化。优选地，所述纯化为柱层析纯化，所述柱层析纯化的洗脱液需要在10℃以内低温透析。更优选地为4℃透析，透析后对蛋白进行定量，优选地，所述定量利用BCA法。本专利技术还提供了信号肽和分子伴侣在人甲状腺过氧化物酶表达中的应用，所述信号肽包括PAM(SEQIDNO：1)、DBip(SEQIDNO：2)、Melittin(SEQIDNO：3)或GP64(SEQIDNO：4)；所述分子伴侣包括Bip(SEQIDNO：8)、PDI(SEQIDNO：9)、Calnexin(SEQIDNO：10)或HSP70(SEQIDNO：11)。本专利技术的有益效果在于：(1)通过信号肽的筛选，可以确定最高分泌的信号肽，不仅可以提高产量，同时为分子伴侣提高产量打下基础。(2)利用分子伴侣与TPO共表达，帮助TPO蛋白正确折叠并促进蛋白从细胞内分泌到细胞外，可以将产量在未使用分子伴侣的基础上提升5倍左右。(3)表达蛋白的纯度大于95％，同时下游应用评价，对临床样品的评价结果较好，可以作为可靠优质诊断原料应用。附图说明图1是；添加信号肽标签的人TPO蛋白表达情况；图2是；纯化后的共表达人TPO蛋白；图3是：本方法生产TPO与市售天然TPO相关性实验。具体实施例为了使本专利技术的目的、技术方案和有点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术的实施方式作进一步的详细描述。实施例1：信号肽筛选人TPO基因序列(SEQIDNO：7)由上海捷瑞生物技术有限公司合成，N端添加不同信号肽(表1)，然后构建到pfastbac1载体中，转入DH10bac细菌中进行蓝白班筛选和PCR验证(引物M13F5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’，M13R5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’，)，确定正确后，提取bacmid质粒。转入SF9细胞进行病毒制作，扩大到p3代后，利用qPCR进行病毒滴度定量。最后在H.five细胞中进行表达验证，利用ELISA检测试剂盒(ThroidperoxidasehumanELISAkit，Invitrogen)进行定量，结果如表2，其中PAM、DBip、Melittin和GP64信号肽标签的TPO表达量较高，适合后续实验，其中Melittin效果最好；而AZU1和Serumalbuminpreproprotein虽然有活性，但表达量极低。同时进行SDS-PAGE分析，结果如图1所示，其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增加人甲状腺过氧化物酶表达产量的试剂，其特征在于，包括信号肽和分子伴侣。/n

【技术特征摘要】
1.一种增加人甲状腺过氧化物酶表达产量的试剂，其特征在于，包括信号肽和分子伴侣。


2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述信号肽包括Pepidylglycinealphaamidatingmonooxygenase(PAM，SEQIDNO:1)、DBip(SEQIDNO:2)、Melittin(SEQIDNO:3)和GP64(SEQIDNO:4)。


3.如权利要求1或2所述的试剂，其特征在于，所述分子伴侣为Bip(SEQIDNO:8)、PDI(SEQIDNO:9)、Calnexin(SEQIDNO:10)或HSP70(SEQIDNO:11)中的一种或几种。


4.一种增加人甲状腺过氧化物酶表达产量的方法，其特征在于，包括：
A、信号肽标记的TPO转入病毒细胞，制作TPO病毒；
B、分子伴侣转入病毒细胞，制作分子伴侣病毒；
C、将步骤A所述的TPO病毒和步骤B所述的分子伴侣病毒导入昆虫细胞中进行表达，得TPO蛋白。


5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述信号肽选自：PAM(SEQIDNO:1)、DBip(SEQIDNO:2...

【专利技术属性】
技术研发人员：易维京，冯奇，曹莎莎，李乾，付鹏德，张丽华，姬成东，赵忠颢，
申请(专利权)人：重庆中元汇吉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50