一种荧光NP-Au靶向造影剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属生物医用材料和造影剂制备的技术领域，涉及一种荧光NP‑Au靶向造影剂及其制备方法和应用。一种荧光NP‑Au靶向造影剂，该靶向造影剂以TAMs标志物CD163/MMR/Arg‑1为靶点，所述荧光NP‑Au靶向造影剂在制备肿瘤靶向造影剂中的应用。本发明专利技术采用多孔纳米新材料荧光NP‑Au，利用分子生物学等技术深入研究荧光NP‑Au靶向造影剂在组织细胞中的成像能力，该造影剂能够对肿瘤中的TAMs进行靶向显影。

【技术实现步骤摘要】
一种荧光NP-Au靶向造影剂及其制备方法和应用
本专利技术属生物医用材料和造影剂制备的
，涉及一种荧光NP-Au靶向造影剂及其制备方法和应用。
技术介绍
在肿瘤发生机制的研究中，其发生发展不但是由于肿瘤细胞自身的恶变，同时与肿瘤微环境关系密切。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages，TAMs)是肿瘤微环境中最丰富的免疫细胞，是免疫抑制细胞中重要的一员。TAMs通过创造促变异的炎性环境，分泌免疫抑制因子、细胞因子和生长因子，抑制T细胞的增殖和活化，调节并促进Th2型免疫应答，促进肿瘤细胞侵袭、参与肿瘤血管新生和促进肿瘤的浸润和转移。研究表明，TAMs存在于肿瘤发展的所有阶段，其数量与肿瘤的恶性程度和不良预后相关，在肿瘤的侵袭和转移过程中起到了促进作用，而靶向抑制TAMs可减少肿瘤生长、增殖和转移。在结肠癌小鼠模型中，使用CSF-1R抗体靶向调控TAMs极化导致小鼠肿瘤体积显著减少和长期生存，表明TAMs可以作为肿瘤治疗研究中强有力的靶标。
技术实现思路
鉴于现有技术存在的问题，本专利技术目的在于提供一种荧光NP-Au靶向造影剂及其制备方法和应用，本专利技术采用多孔纳米新材料荧光NP-Au，利用分子生物学等技术深入研究荧光NP-Au靶向造影剂在组织细胞中的成像能力，该造影剂能够对肿瘤中的TAMs进行靶向显影。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。一种荧光NP-Au靶向造影剂，该靶向造影剂以TAMs标志物CD163/MMR/Arg-1为靶点。进一步地，所述荧光NP-Au靶向造影剂的制备方法，具体包括以下步骤。步骤1、将1MHEPES用dd水稀释为20mmol缓冲液，分别取5μl、6μl、7μl、8μl、9μlCD163抗体溶于20mmolHEPES缓冲液中，得到50μl混合液。步骤2、将不同浓度的CD163抗体溶液分别与1ml金纳米棒溶液作用，30分钟后测量各溶液的吸光度；当金纳米棒溶液最大吸收峰值不变时，进入吸收峰平台的初始浓度即为所需最佳CD163抗体浓度。步骤3、取该浓度混合物溶液1ml加入50μl聚乙二醇作用10分钟后，在4℃下以15000rmb的转速离心15分钟，得到mAb-CD163/Au共轭物；然后弃去上清液，加入PBS缓冲液，得到分散良好稳定的溶液，4℃下保存。进一步地，所述荧光NP-Au靶向造影剂在制备肿瘤靶向造影剂中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下。本专利技术提供的荧光NP-Au靶向造影剂，采用荧光NP-Au利用分子生物学等技术，深入研究靶向性NP-Au在组织细胞中的成像能力。向微环境中非肿瘤细胞的优势是荧光NP-Au靶向造影剂的基因更稳定，更不容易形成耐药。从肿瘤微环境相关的巨噬细胞着手，研究TAMs在肿瘤中的靶向显像。实验证明mAb-CD163/Au在M2型巨噬细胞内的聚集明显多于M1型巨噬细胞，说明M2型巨噬细胞表面高表达CD163分子，因此可以吞噬更多的mAb-CD163/Au；随着纳米颗粒浓度的增加，存活细胞越少。当浓度相同时，mAb-CD163/Au+NIR组细胞被杀伤的情况最明显；通过靶向杀伤瘤周组织内CD163(+)巨噬细胞，可以抑制肿瘤的生长。附图说明图1是金纳米棒溶液的流式图像。图2是mAb-CD163/Au的流式图像。流式图像峰值明显右移，说明制备的mAb-CD163/Au表明含有CD163抗体。图3是金纳米棒溶液吸收峰。图4是经CD163抗体包裹后，mAb-CD163/Au的吸收峰略右移。经CD163抗体包裹的金纳米颗粒，光学性质没有明显改变，其在1064nm附近仍具有吸收峰。图5是双光子显微镜观察mAb-CD163/Au在巨噬细胞内的聚集情况结果，其中，图5a为经PMA诱导后，mAb-CD163/Au在M1型巨噬细胞内的聚集情况；图5b为经PMA、IL-4诱导后，mAb-CD163/Au在M2型巨噬细胞内的聚集情况。图6是经1064nm激光照射后，分别于0min、1min、2min、3min、4min、5min时，各组溶液温度变化的情况。图7是经近红外激光处理后各组细胞被杀伤的情况。图8a-8f是荧光NP-Au靶向造影剂的体内细胞实验结果。其中，图8a为照射15天后，各组裸鼠成瘤情况；图8b为各组裸鼠肿瘤生长曲线；图8c、8d、8e分别为各组瘤周组织CD163(+)巨噬细胞免疫组化；图8f为显示各组瘤周组织CD163(+)巨噬细胞免疫组化具有统计学差异。具体实施方式下面结合具体实施例和附图详细介绍本专利技术的技术方案和技术效果。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域普通技术人员熟知或易于获知，以下实施例仅为本专利技术的优选实施例，并不限制本专利技术，对于本领域的技术人员来说，本专利技术可以有各种更改和变化，凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。实施例1荧光NP-Au靶向造影剂的制备方法。1、材料和试剂。HEPES：pH7.2-7.4；H1095(100ml)：1M，Solarbio；聚乙二醇(PEG200)；P8490：500ml，Solarbio；APCanti-humanCD163(monoclonal)，Biolegend；金纳米棒，NR-9-1064，OD2，上海羧菲生物医药科技有限公司。2、制备方法。所述荧光NP-Au靶向造影剂的制备方法包括以下具体步骤。步骤1、将1MHEPES用双蒸水(dd水)稀释为20mmol缓冲液。分别取5μl、6μl、7μl、8μl、9μlCD163抗体溶于20mmolHEPES缓冲液中，得到50μl混合液。步骤2、将不同浓度的CD163抗体溶液分别与1ml金纳米棒溶液作用，30分钟后测量各溶液的吸光度。当金纳米棒溶液最大吸收峰值不变时，进入吸收峰平台的初始浓度即为所需最佳CD163抗体浓度。步骤3、取该浓度混合物溶液1ml加入50μl聚乙二醇作用10分钟后，在4℃下离心(15000x)15分钟，得到mAb-CD163/Au共轭物。然后弃去上清液，加入PBS缓冲液，得到分散良好稳定的溶液，4℃下保存。实施例2荧光NP-Au靶向造影剂的表征及体外细胞实验。1、金纳米颗粒表面CD163抗体的检测。1)实验材料。实施例1制备好的mAb-CD163/Au溶液。2)实验方法。使用紫外—可见光分光光度计测量溶液吸收峰；使用马尔文粒径仪测量溶液物理属性；使用流式细胞仪验证金纳米颗粒表面包裹CD163抗体。3)实验结果。实验结果如图1-4所示。图1为金纳米棒溶液的流式图像；图2为mAb-CD163/Au的流式图像，图2流式图像峰值明显右移，说明制备的mAb-CD163/Au表明含有CD163抗体。图3为金纳米棒溶液吸收峰本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光NP-Au靶向造影剂，其特征在于，所述荧光NP-Au靶向造影剂以TAMs标志物CD163/MMR/Arg-1为靶点。/n

【技术特征摘要】
1.一种荧光NP-Au靶向造影剂，其特征在于，所述荧光NP-Au靶向造影剂以TAMs标志物CD163/MMR/Arg-1为靶点。


2.如权利要求1所述的荧光NP-Au靶向造影剂的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1、将1MHEPES用水稀释为20mmol缓冲液，分别取5μl、6μl、7μl、8μl、9μlCD163抗体溶于20mmolHEPES缓冲液中，得到50μl混合液；
步骤2、将不同浓度的CD163抗体溶液分别与1ml金纳米棒溶液作用，30分钟后测量各溶液的吸光度；当金...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄瑛，王博，庄连婷，史婧文，朱天彤，
申请(专利权)人：中国医科大学附属盛京医院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21