一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统及方法技术方案

本发明专利技术提供一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统及方法，属于细胞生物学实验装置技术领域。利用流体力学的虹吸原理和微流控芯片技术设计恒流泵、生化因子浓度梯度生成器和细胞培养室。恒流泵用于调控入口溶液及其流量，可以在细胞培养腔内制造尺寸可控的细胞“划痕”条带，特殊的微流控芯片结构设计可在细胞培养腔内产生剪切力与生化因子空间梯度组合刺激。微型细胞培养箱可通过温度及气体传感器实时监测箱内温度和气体浓度等信息，并将检测和传感数据反馈给控制系统，为微流控芯片上的细胞提供最适宜的细胞生存环境。结合荧光显微成像系统实时监测剪切力和生化因子组合刺激条件下细胞“划痕”修复的动力学过程。

【技术实现步骤摘要】
一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统及方法
本专利技术属于细胞生物学实验装置
，是基于流体力学原理和微流控芯片技术，由可生成生化因子浓度空间梯度的微流控芯片、可自主灌注产生定常流剪切力的恒流微泵、以及微型细胞培养箱等构成的用于研究剪切力和生化因子梯度调控细胞“划痕”修复的微流控系统及方法。
技术介绍
细胞划痕试验是体外评价细胞增殖和迁移能力的重要方法。一般在常规的培养皿或培养板上体外培养细胞，当细胞生长至融合单层状态时，在融合的单层细胞上用机械方法人为制造一个空白区域，称为“划痕”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”修复，用显微镜实时观测细胞迁移期间动态图像，后期分析处理动态图像数据，得到细胞迁移速率等评估细胞增殖和迁移能力的指标。细胞划痕修复受所处的微环境调控。细胞微环境的参数可以分为生物化学因素和生物物理因素两大类。生物化学因素主要包括各种生化因子的浓度及浓度梯度分布变化，生物物理因素主要包括机械力的作用如流体剪切力等。传统的培养皿或培养板体系只能提供静态的生化因子作用环境，无法产生流体剪切力的作用；此外，采用机械方法制造细胞划痕的方法不可避免地对细胞造成机械损伤，影响划痕边缘部位的细胞功能。随着微纳制造和微流控技术的快速发展，使用微流控芯片技术制造细胞划痕、精确模拟剪切力和生化因子梯度微环境开展各种细胞划痕试验越来越普遍。这些装置和系统通常需要将微流控芯片连接有源压力泵及外部控制系统实现压力和流量的精确控制，从而实现细胞划痕宽度、剪切力和生化因子空间梯度的精准模拟。然而，这些装置和系统具有庞大的压力泵及其外围控制装置，不便整体放置于培养箱中进行长时间的细胞培养和观察。因此，迫切需要设计和构建一种具有无源自主灌注恒流微泵、微流控芯片以及微型细胞培养箱组成的微流控系统及方法，用于研究剪切力与生化因子浓度空间梯度调控细胞“划痕”修复动力学过程。
技术实现思路
本专利技术的目的在于设计和构建一种无源自主灌注恒流微泵、微流控芯片以及微型细胞培养箱组成的微流控系统及方法，用于研究剪切力与生化因子浓度空间梯度调控细胞“划痕”修复动力学过程。利用流体力学的虹吸原理和微流控芯片技术设计恒流微泵、生化因子浓度梯度生成器和细胞培养室。恒流微泵用于调控入口溶液及其流量，可以在细胞培养腔内制造尺寸可控的细胞“划痕”条带，特殊的微流控芯片结构设计可在细胞培养腔内产生剪切力与生化因子空间梯度组合刺激。微型细胞培养箱可通过温度及气体传感器实时监测箱内温度和气体浓度等信息，并将检测和传感数据反馈给控制系统，为微流控芯片上的细胞提供最适宜的细胞生存环境。进一步结合细胞“划痕”试验检测装置实时监测剪切力和生化因子组合刺激条件下细胞“划痕”修复的动力学过程。本专利技术的技术方案如下：一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统，包括恒流微泵A、微型细胞培养箱B、微流控芯片C和细胞“划痕”试验检测装置D；所述的恒流微泵A包括恒流发生器A-1和弹性阻尼器A-2；恒流发生器A-1的个数根据实际需要进行调整；恒流发生器A-1包括离心管和两端开口的软管；弹性阻尼器A-2为圆柱形透明管，其顶部连接有一个可开关的接头，用于控制是否与大气相通；弹性阻尼器A-2一端通过软管与恒流发生器A-1相连，另一端和微流控芯片C中“圣诞树”型微通道“树顶”端的四个入口相通，用于灌注细胞培养基、生化因子溶液或胰蛋白酶溶液；所述的微型细胞培养箱B包括外围温度控制及反馈装置、气体数字混合器及气体传感器反馈控制装置；用于实时监测、反馈和控制微型细胞培养箱B内温度和气体浓度，为微流控芯片C上的细胞培养提供良好的环境；所述微流控芯片C包括“圣诞树”型浓度梯度生成器C-1、细胞培养基入口2、细胞培养腔C-2、溶液出口3；其中“圣诞树”型浓度梯度生成器C-1包括第一入口1-1、第二入口1-2、第三入口1-3、第四入口1-4和“圣诞树”型微通道；第一入口1-1、第二入口1-2、第三入口1-3、第四入口1-4分别设置于“圣诞树”型微通道的“树顶”端，“圣诞树”型微通道的“树根”端汇集并与细胞培养腔C-2相通；细胞培养腔C-2包括三个入口和一个出口，其中一个入口与“圣诞树”型微通道相通，另外两个入口分布于“圣诞树”型微通道两侧，并汇集成一个细胞培养基入口2。溶液出口3位于细胞培养腔C-2的尾端。所述的细胞“划痕”试验检测装置D包括倒置荧光显微镜成像系统，用于实时监测细胞培养腔C-2内划痕修复进程的实际状态。所述的恒流发生器A-1中两端开口的软管下端开口处的压强始终保持与外界大气压相同；往离心管加入液体，液体上方封闭一段空气柱，满足气体状态方程:P1V1＝C1(1)其中，P1为气体压强，V1为气体体积，C1是常数。设a点为恒流发生器内液面所处位置；b点为两端开口软管下端所处位置；c点为恒流发生器液体流出位置；若液面高度高于软管下端开口处，则由于重力作用液体从c点流出，离心管中的水面下降，水面上方密闭的气体体积增大，气体压强减少，液体下流的速度就会减慢，导致容器内b点的水平面压力小于外界大气压，外界气体会在大气压的作用下通过软管下端的b口补气。设c点的高度为Hc＝0，b点的高度为Hb，a和b两点之间的距离为△H，液体从c点流出的速度大小根据伯努利方程进行求解：其中，C2为常数，V2为流体中某点的流速，H2为流体中该点的高度，P2为该点的压强，ρ为流体密度，g为重力加速度；设c点的压强为Pc，c点流速为Vc，b点的压强为Pb，b点流速为Vb,则根据用伯努利方程(2)得：其中b点处与c点处均与大气接触，所以Pb＝Pc＝Patm。Patm为大气压强。由于整个容器的横截面面积远大于c点的面积，根据连续性方程，Vb＜＜Vc，故认为Vb＝0。将前述条件代入公式(3)，即求得c点处液体流动速度为：由公式(4)得：当ΔH>0时，Hb是恒定的，此时溶液从c孔流出的速度是恒定的，其大小取决于Hb的大小。当液体由恒流发生器A-1流出经过弹性阻尼器A-2时，由于弹性阻尼器A-2顶部的接头被关闭，因此封闭在弹性阻尼器A-2内的空气由于其弹性作用，可将恒流发生器A-1因加气循环所产生的波动流转变为定常流，起到类似滤波的作用，如需要调节弹性阻尼器A-2内空气柱的高度，则可通过打开接头进行调节。弹性阻尼器A-2弹性腔的顺应性可以通过如下的公式进行计算：其中，VA-2是弹性腔内空气柱的体积，PA-2是弹性腔内空气柱的压力，n是一个多方指数，n≥1，由于顺应性的调节过程中温度保持不变，所以n＝1。A是弹性腔的内截面积，h是弹性腔内空气柱的长度，Patm和P0分别为大气压以及液体作用于空气柱的压力。因此，如果给定了弹性腔顺应性C3的具体数值，那么在硅胶管内截面积已知的情况下，通过上述的公式(5)便可得到弹性腔内所需空气柱的高度h。“圣诞树”型浓度梯度生成器C-1具有以下特点：第一，“圣诞树”型微通道的第一级混合通道的个数总是比本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统，其特征在于，包括恒流微泵(A)、微型细胞培养箱(B)、微流控芯片(C)和细胞“划痕”试验检测装置(D)；/n所述的恒流微泵(A)包括恒流发生器(A-1)和弹性阻尼器(A-2)；恒流发生器(A-1)包括离心管和两端开口的软管；弹性阻尼器(A-2)为圆柱形透明管，其顶部连接有一个可开关的接头，用于控制是否与大气相通；弹性阻尼器(A-2)一端通过软管与恒流发生器(A-1)相连，另一端和微流控芯片(C)中“圣诞树”型微通道“树顶”端的四个入口相通，用于灌注细胞培养基、生化因子溶液或胰蛋白酶溶液；/n所述的微型细胞培养箱(B)包括外围温度控制及反馈装置、气体数字混合器及气体传感器反馈控制装置；用于实时监测、反馈和控制微型细胞培养箱(B)内温度和气体浓度，为微流控芯片(C)上的细胞培养提供良好的环境；/n所述微流控芯片(C)包括”圣诞树”型浓度梯度生成器(C-1)、细胞培养基入口(2)、细胞培养腔(C-2)、溶液出口(3)；其中”圣诞树”型浓度梯度生成器(C-1)包括第一入口(1-1)、第二入口(1-2)、第三入口(1-3)、第四入口(1-4)和“圣诞树”型微通道；第一入口(1-1)、第二入口(1-2)、第三入口(1-3)、第四入口(1-4)分别设置于“圣诞树”型微通道的“树顶”端，“圣诞树”型微通道的“树根”端汇集并与细胞培养腔(C-2)相通；细胞培养腔(C-2)包括三个入口和一个出口，其中一个入口与“圣诞树”型微通道相通，另外两个入口分布于“圣诞树”型微通道两侧，并汇集成一个细胞培养基入口(2)；溶液出口(3)位于细胞培养腔(C-2)的尾端；/n所述的细胞“划痕”试验检测装置(D)包括倒置荧光显微镜成像系统，用于实时监测细胞培养腔(C-2)内划痕修复进程的实际状态。/n...

【技术特征摘要】
1.一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统，其特征在于，包括恒流微泵(A)、微型细胞培养箱(B)、微流控芯片(C)和细胞“划痕”试验检测装置(D)；
所述的恒流微泵(A)包括恒流发生器(A-1)和弹性阻尼器(A-2)；恒流发生器(A-1)包括离心管和两端开口的软管；弹性阻尼器(A-2)为圆柱形透明管，其顶部连接有一个可开关的接头，用于控制是否与大气相通；弹性阻尼器(A-2)一端通过软管与恒流发生器(A-1)相连，另一端和微流控芯片(C)中“圣诞树”型微通道“树顶”端的四个入口相通，用于灌注细胞培养基、生化因子溶液或胰蛋白酶溶液；
所述的微型细胞培养箱(B)包括外围温度控制及反馈装置、气体数字混合器及气体传感器反馈控制装置；用于实时监测、反馈和控制微型细胞培养箱(B)内温度和气体浓度，为微流控芯片(C)上的细胞培养提供良好的环境；
所述微流控芯片(C)包括”圣诞树”型浓度梯度生成器(C-1)、细胞培养基入口(2)、细胞培养腔(C-2)、溶液出口(3)；其中”圣诞树”型浓度梯度生成器(C-1)包括第一入口(1-1)、第二入口(1-2)、第三入口(1-3)、第四入口(1-4)和“圣诞树”型微通道；第一入口(1-1)、第二入口(1-2)、第三入口(1-3)、第四入口(1-4)分别设置于“圣诞树”型微通道的“树顶”端，“圣诞树”型微通道的“树根”端汇集并与细胞培养腔(C-2)相通；细胞培养腔(C-2)包括三个入口和一个出口，其中一个入口与“圣诞树”型微通道相通，另外两个入口分布于“圣诞树”型微通道两侧，并汇集成一个细胞培养基入口(2)；溶液出口(3)位于细胞培养腔(C-2)的尾端；
所述的细胞“划痕”试验检测装置(D)包括倒置荧光显微镜成像系统，用于实时监测细胞培养腔(C-2)内划痕修复进程的实际状态。


2.根据权利要求1或2所述的一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统，其特征在于，所述的恒流发生器(A-1)中两端开口的软管下端开口处的压强始终保持与外界大气压相同；往离心管加入液体，液体上方封闭一段空气柱，满足气体状态方程:
P1V1＝C1(4)
其中，P1为气体压强，V1为气体体积，C1是常数；设a点为恒流发生器内液面所处位置；b点为两端开口软管下端所处位置；c点为恒流发生器液体流出位置；若液面高度高于软管下端开口处，则由于重力作用液体从c点流出，离心管中的水面下降，水面上方密闭的气体体积增大，气体压强减少，液体下流的速度就会减慢，导致容器内b点的水平面压力小于外界大气压，外界气体会在大气压的作用下通过软管下端的b口补气；
设c点的高度为Hc＝0，b点的高度为Hb，a和b两点之间的距离为△H，液体从c点流出的速度大小根据伯努利方程进行求解：



其中，C2为常数，V2为流体中某点的流速，H2为流体中该点的高度，P2为该点的压强，ρ为流体密度，g为重力加速度；
设c点的压强为Pc，c点流速为Vc，b点的压强为Pb，b点流速为Vb,则根据用伯努利方程(2)得：



其中b点处与c点处均与大气接触，所以Pb＝Pc＝Patm；Patm为大气压强；由于整个容器的横截面面积远大于c点的面积，根据连续性方程，Vb＜＜Vc，故认为Vb＝0；将前述条件代入公式(3)，即求得c点处液体流动速度为：



由公式(4)得：当ΔH>0时，Hb是恒定的，此时溶液从c孔流出的速度是恒定的，其大小取决于Hb的大小。


3.根据权利要求1或2所述的一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统，其特征在于，当液体由恒流发生器(A-1)流出经过弹性阻尼器(A-2)时，由于弹性阻尼器(A-2)顶部的接头被关闭，因此封闭在弹性阻尼器(A-2)内的空气由于其弹性作用，可将恒流发生器(A-1)因加气循环所产生的波动流转变为定常流，起到类似滤波的作用，如需要调节弹性阻尼器(A-2)内空气柱的高度，则可通过打开接头进行调节；弹性阻尼器(A-2)弹性腔的顺应性可以通过如下的公式进行计算：



其中，VA-2是弹性腔内空气柱的体积，PA-2是弹性腔内空气柱的压力，n是一个多方指数，n≥1，由于顺应性的调节过程中温度保持不变，所以n＝1；A是弹性腔的内截面积，h是弹性腔内空气柱的长度，Patm和P0分别为大气压以及液体作用于空气柱的压力；因此，如果给定了弹性腔顺应性C3的具体数值，那么在硅胶管内截面积已知的情况下，通过上述的公式(5)便可得到弹性腔内所需空气柱的高度h。


4.根据权利要求1或2所述的一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统，其特征在于，”圣诞树”型浓度梯度生成器(C-1)具有以下特点：第一，“圣诞树”型微通道的第一级混合通道的个数总是比入口个数多一个；第二，每一级的混合通道数量有序增加，即下一级混合通道的个数总是比这一级混合通道的个数多一个；第三，结构内所有混合通道的结构完全相同，从而具有相同的流阻；
设i表示“圣诞树”型微通道“树顶”端的入口编号，则Ci＝0，表示入口i的初始质量浓度为零，即不含生化因子的培养基被送入入口i；同理，Ci＝1表示入口i通入含有生化因子且初始浓度为1的溶液；因此4个入口共有24-2种混合含有/不含有生化因子培养基的方法；
由于上下级通道之间的水平通道阻值远小于混合通道的阻值，其阻值可以忽略不计，根据流体力学基本...

【专利技术属性】
技术研发人员：覃开蓉，杨雨浓，李泳江，薛春东，王宇，于苗，王艳霞，吴斯达，胡思毓，赵家铭，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21