抗CD123纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了抗CD123纳米抗体及其应用，所述纳米抗体包括重链可变区；所述重链可变区包括SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2，和SEQ ID NO:3所示的CDR3。本发明专利技术从骆驼VHH免疫文库中筛选的抗体具有SEQ ID NO:1～3所示的CDR区，与不同的框架区FR组合形成的纳米抗体与CD123亲和力强，由此构建的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体免疫细胞对CD123阳性细胞具有显著的细胞毒性，在肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
抗CD123纳米抗体及其应用
本专利技术属于生物医药
，涉及抗CD123纳米抗体及其应用。
技术介绍
30多年前，“3+7”方案(柔红霉素化疗3天联合阿糖胞苷化疗7天)使约60％的AML患者的病情得到缓解，成为治疗儿童和成人急性白血病的标准诱导方案。上世纪90年代，临床专家开始关注缓解后治疗方案及其获益，并进行了大量研究，其中包括高剂量阿糖胞苷化疗或造血干细胞移植(HSCT)。虽然儿童急性白血病的缓解率和总生存率目前已分别达到大于90％和60％，但是现有的治疗方案仍然局限于基于蒽环类药物、核苷类似物和密集的缓解后治疗。为了提高AML患者的预后，临床采用包括米托蒽醌与去甲氧柔红霉素的替代治疗、阿糖胞苷强化治疗等方案，然而大多数临床研究显示各治疗组的结局不存在显著差异。干细胞移植治疗白血病的疗效表明，抗肿瘤免疫可以有效消除和防止白血病复发。事实上，许多研究发现，与化疗相比，造血干细胞移植的复发率明显降低。然而，由于造血干细胞移植的死亡率高，在缓解期进行造血干细胞移植存在争议。近年来，随着支持治疗的改进，全面的HLA和NK分型有助于降低造血干细胞移植治疗的副作用。酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)已成为重要的化疗方案之一。例如，FLT3基因(FLT3ITD)可引发约15％的儿童AML和30％的成人AML，且与不良结局相关，FLT3-ITD/野生型FLT3比例较高的个体表现出更为显著的预后不良。索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼和其他FLT3抑制剂可以有效抑制FLT3突变，但是长期使用这些药物会出现耐药现象，这主要与D835或F691激酶区点突变有关。新型酪氨酸激酶抑制剂crenolanib，对索拉非尼(Sorafenib)耐药的AML小鼠模型有较好的治疗作用，提示该抑制剂可以延长临床受益。虽然TKIs提供了不同的白血病治疗方案，但是仍然处于发展阶段，临床需要更多的治疗策略。嵌合抗原受体修饰T淋巴细胞(ChimericantigenreceptorTcells，CAR-T)的概念早在1989年就已出现，但是在临床试验中一直未能达到理想的效果。此后的二十多年时间里，科学家们不断地对该技术进行优化，直到2011年，靶向CD19(BlymphocyteantigenCD19，CD19)的CAR-T细胞在治疗复发/难治性慢性B淋巴细胞白血病方面取得了惊人疗效，CAR-T细胞在肿瘤治疗上的应用开启了新的篇章。嵌合抗原受体是人工合成的功能类似于T细胞受体的融合蛋白，主要包括信号肽、抗原识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号区。在结合靶抗原后，嵌合抗原受体形成聚体、通过胞内信号分子活化T细胞，分泌穿孔素和颗粒酶素B，实现对靶细胞的杀伤。CAR-T细胞识别靶细胞不依赖于主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)，避免了因肿瘤细胞MHC分子下调而导致的免疫逃逸。近年来，嵌合抗原修饰的T淋巴细胞(CAR-T)发展迅速，目前已有两款产品获美国FDA批准上市，国内也有多个产品取得药物临床试验批准。CD123也称CD3受体α链，表达于白血病细胞和白血病干细胞上，正常造血干细胞不表达或弱表达，在内皮细胞和单核细胞、浆细胞DC上也表达，但是CD123阳性的单核细胞和浆细胞在反应性淋巴结中只占很小的比例。高表达CD123促进了肿瘤细胞的增殖。CD123是目前研究较多的一种AML抗原，现已研发出几种靶向CD123的单克隆抗体类药物，如7G3、CSL360和CSL362正在进行临床前及临床试验。此外，靶向CD123的CAR-T治疗也已完成临床前研究并显示出显著的抗瘤效应。将抗CD123的嵌合抗原受体基因通过基因工程方法导入T细胞制备CD123CAR-T，使得CD123CAR-T细胞特异性识别表达CD123的急性髓系白血病细胞并清除肿瘤细胞，从而实现其抗肿瘤作用。因此，靶向CD123的免疫治疗方法具有较大的临床转化价值。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了抗CD123纳米抗体及其应用，利用噬菌体展示技术筛选到高亲和力的抗CD123纳米抗体，作为嵌合抗原受体分子的抗原结合结构域构建CAR-T细胞，所述CAR-T细胞能够特异性识别杀伤CD123阳性细胞，在肿瘤的治疗领域具有重要的应用前景。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了抗CD123的纳米抗体，所述纳米抗体包括重链可变区；所述重链可变区包括SEQIDNO:1所示的CDR1，SEQIDNO:2所示的CDR2，和SEQIDNO:3所示的CDR3；SEQIDNO:1：GFTFSSYD；SEQIDNO:2：IKPGPVGT；SEQIDNO:3：ARGSRYSWNLDGPL。本专利技术中，从CD123免疫骆驼VHH免疫文库中筛选具有高亲和性的抗体，发现当抗体重链可变区的CDR区为SEQIDNO:1～3所示的氨基酸序列时，与不同的框架区FR组合可以获得特异性结合CD123、且亲和力强的抗体，因此，SEQIDNO:1～3所示的CDR区对于抗体与CD123的亲和性具有决定性作用。优选地，所述纳米抗体的重链可变区包括SEQIDNO:4或SEQIDNO:5所示的氨基酸序列；SEQIDNO:4：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSHIKPGPVGTDYTDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMDSLKTEDTAVYYCARGSRYSWNLDGPLRGQGTQVTVSS；SEQIDNO:5：EVQLVESGGDLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSHIKPGPVGTDYTDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMDSLKTEDTAVYYCARGSRYSWNLDGPLRGQGTQVTVSS。本专利技术中，利用噬菌体展示技术对CD123免疫骆驼VHH文库进行筛选，得到了仅含有重链可变区的抗CD123纳米抗体CD123-9(SEQIDNO:4)和CD123-12(SEQIDNO:5)，两种纳米抗体具有相同的CDR区SEQIDNO:1～3，对CD123亲和性高，在构建靶向CD123的嵌合抗原受体方面具有重要的应用前景。第二方面，本专利技术提供了核酸分子，所述核酸分子包括编码第一方面所述的纳米抗体的DNA片段。优选地，所述核酸分子包括SEQIDNO:6或SEQIDNO:7所示的核酸序列，其中，SEQIDNO:6为CD123-9的编码序列，SEQIDNO:7为CD123-12的编码序列；SEQIDNO:6：GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCTGGCTTTACATTTTCTTCTTATGATATGAGCTGGGTGAGACAGGCTCCAGGAAAAGGACTGGAGTGGGTGTCTCATAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗CD123的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括重链可变区；/n所述重链可变区包括SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2，和SEQ IDNO:3所示的CDR3。/n

【技术特征摘要】
1.抗CD123的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括重链可变区；
所述重链可变区包括SEQIDNO:1所示的CDR1，SEQIDNO:2所示的CDR2，和SEQIDNO:3所示的CDR3。


2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的重链可变区包括SEQIDNO:4或SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。


3.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码权利要求1或2所述的纳米抗体的DNA片段；
优选地，所述核酸分子包括SEQIDNO:6或SEQIDNO:7所示的核酸序列。


4.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号转导结构域；
所述抗原结合结构域为权利要求1或2所述的纳米抗体。


5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽包括CD8α信号肽；
优选地，所述铰链区包括CD8α铰链区；
优选地，所述跨膜结构域包括CD8α跨膜区、CD28跨膜区或DAP10跨膜区中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述信号转导结构域包括CD3ζ；
优选地，所述信号转导结构域还包括4-1BB、CD28胞内区、OX40、ICOS或DAP10胞内区中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述嵌合抗原受体包括权利要求1或2所述的纳米抗体、CD8α跨膜区、4-1BB和CD3ζ；
优选地，所述嵌合抗原受体包括权利要求1或2所述的纳米抗体、CD28跨膜区、CD28胞内区和CD3ζ；
优选地，所述嵌合抗原受体包括权利要求1或2所述的纳米抗体、CD8α跨膜区、OX40和CD3ζ；
优选地，所述嵌合抗原受体...

【专利技术属性】
技术研发人员：狄升蒙，侯莉，石磊，刘芳，茅健，余学军，
申请(专利权)人：华道上海生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31