香葱内参基因及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术提供一种香葱内参基因及其筛选方法和应用，属于分子生物学领域。选取13个候选内参基因Ac18S、Af18s、Af28s、AcActin、AfActin、AfTUA、AfTUB、AsSAND、AfMYH、AfGAPDH、AfUBQ、AfEF1a、AfCYC，利用实时荧光定量RT

【技术实现步骤摘要】
香葱内参基因及其筛选方法和应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及香葱内参基因及其筛选方法和应用。

技术介绍

[0002]香葱，又称：葱、细香葱、北葱、火葱。拉丁文名：Allium fistulosum L.var.caespitosum Makino.百合科、葱属植物，鳞茎聚生，矩圆状卵形、狭卵形或卵状圆柱形；鳞茎外皮红褐色、紫红色至黄白色，膜质或薄革质，不破裂。叶为中空的圆筒状，向顶端渐尖，深绿色，常略带白粉。植株小，叶极细，质地柔嫩，味清香，微辣，主要用于调味和去腥。原产于亚洲西部，在我国南方较为广泛的栽培，欧洲和亚洲的一些地方也有栽培。香葱既是日常必不可少的重要辛香调料，更是重要的参与精准扶贫、南菜北运、出口脱水蔬菜品种。
[0003]香葱性喜冷凉。在南方地区香葱周年生产情况下，高温是香葱夏秋生产中面临的最大产业瓶颈。高温环境下极易造成葱管退绿、葱尖干黄、葱白腐烂、组织老化和纤维增多、病害频发甚至绝收等现象，严重影响香葱的产量、品质和效益。针对产业需求开展香葱耐热分子机理机制研究有非常重要的理论和应用价值。
[0004]基因功能的行使是从DNA到mRNA再到蛋白的一个过程，基因表达水平一般是通过基因转录mRNA的量来衡量。因此，准确评估目标基因的表达量对研究其生物学功能意义重大。内参基因即内源性参照基因，理想上内参基因应在所有组织、细胞中均有表达，在不同环境、条件下均能稳定表达且不受任何内外因素影响。而在实际研究过程中，常用内参基因的表达在不同组织器官中、不同处理条件下、不同类型细胞中和不同发育阶段中并不绝对恒定，因此，在利用荧光定量PCR进行目的基因表达的研究时，第一步应根据不同的试验条件、试验样品筛选合适稳定的内参基因。常见的内参基因有β
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actin、EF
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1α、18S rRNA、28S rRNA等。目前为止，尚未见高温胁迫下香葱专用内参基因相关研究的报道。这严重制约了香葱分子育种研究进程。因此，在香葱中挖掘高度可信的内参基因十分必要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的专利技术目的是，针对上述问题，提供一种香葱内参基因，为后续香葱基因表达相关的科学研究提供了参考。
[0006]为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0007]一种香葱内参基因，所述内参基因为AfActin，所述内参基因AfActin的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]还提供了一种用于扩增权利要求1所述内参基因的PCR引物，所述PCR引物的核苷酸序列是：正向序列如SEQ ID NO.2所示；反向序列如SEQ ID NO.3。
[0009]还提供了一种香葱内参基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0010]S1、选择10个香葱基因和3个其他品种内参基因作为内参候选基因，其中，10个香葱基因为：Af18s、Af28s、AfActin、AfTUA、AfTUB、AfMYH、AfGAPDH、AfUBQ、AfEF1a和AfCYC；3个其他品种内参基因为：洋葱Ac18s、洋葱AcActin、大蒜AsSAND；并设计荧光定量PCR引物。
[0011]S2、提取高温胁迫处理下的“桂香葱1号”以及“AF35”的总RNA，反转录成cDNA，作为荧光定量PCR的模板，以步骤S1中设计的引物为荧光定量PCR引物，进行荧光定量PCR实验，获得荧光定量PCR数据。
[0012]S3、利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对步骤S2中获得的荧光定量PCR数据进行表达稳定性分析，筛选出稳定表达的内参基因。
[0013]优选的，高温胁迫处理条件为：白天6:00
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20：00：38℃，湿度70％，光照3；晚上20:00
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次日6:00，35℃，湿度65％，光照0；对照组非胁迫条件为：白天6:00
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20：00：23℃，湿度70％，光照3.晚上20:00
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次日6:00，20℃，湿度65％，光照0。分别于处理的0h、6h、12h、24h、48h、72h时收集香葱叶片。
[0014]优选的，采用Primer Premier3.0根据香葱转录组数据进行内参候选基因引物设计，引物长度为18～23bp，Tm值在57～62℃之间，产物大小在100～200bp之间，并在NCBI上对引物的特异性进行检测。
[0015]优选的，采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件分别计算出不同处理下内参基因的表达稳定性M值、稳定值SV值和变异系数CV/标准偏差SD值，并根据M值、SV值、CV值、SD值按从小到大对内参基因表达稳定性分别进行排序，M值、SV值、CV值、SD值均为越小对应的内参基因越稳定。
[0016]对各软件中得到的稳定性排名分别进行赋分，求几何平均值，得到综合指数排名，平均值越小即为排名越前，说明内参基因表达越稳定。
[0017]还提供了香葱内参基因在香葱基因表达分析中的应用。
[0018]由于采用上述技术方案，本专利技术具有以下有益效果：
[0019]1.本专利技术的香葱内参基因，针对产业中香葱耐热品种开发和分子辅助育种需求，首次提出将AfActin基因作为内参基因用于香葱的基因表达，解决了香葱没有内参基因的现状。
[0020]2.本专利技术的香葱内参基因的筛选方法，对13个候选内参基因进行了Genorm、NormFinder和BestKeeper软件分析稳定性。对各软件中得到的稳定性排名分别进行赋分，求几何平均值，得到综合指数排名，综合分析各软件结果，成功筛选出适用的稳定内参基因。
[0021]3.本专利技术提出的检测引物对具有特异性，优化了PCR扩增程序，大大提高了检测效率、缩短了检测时间，提高了检测结果的可信度以及香葱基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性。
附图说明
[0022]图1为本专利技术实施例3中13个内参候选基因溶解曲线；
[0023]图2为本专利技术实施例3中13个内参候选基因Ct值分布箱型图；
[0024]图3为本专利技术实施例3中13个内参候选基因内参基因的平均表达稳定性M值图；
[0025]图4为本专利技术实施例3中最佳组合数的配对变异系数分析。
具体实施方式
[0026]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例与附图，对
本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0027]实施例1
[0028]一种香葱内参基因，所述内参基因为AfActin，所述内参基因AfActin的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0029]实施例2
[0030]一种内参基因AfActin的PCR扩增引物，所述PCR引物的核苷酸序列是：正向序列如SEQ ID NO.2所示；反向序列如SEQ ID NO.3。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.香葱内参基因，其特征在于，所述内参基因为AfActin，所述内参基因AfActin的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.用于扩增权利要求1所述内参基因的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物的核苷酸序列是：正向序列如SEQ ID NO.2所示；反向序列如SEQ ID NO.3。3.一种如权利要求1所述的香葱内参基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、选择10个香葱基因和3个其他品种内参基因作为内参候选基因，其中，10个香葱基因为：Af18s、Af28s、AfActin、AfTUA、AfTUB、AfMYH、AfGAPDH、AfUBQ、AfEF1a和AfCYC；3个其他品种内参基因为：洋葱Ac18s、洋葱AcActin、大蒜AsSAND；并设计荧光定量PCR引物；S2、提取高温胁迫处理下的“桂香葱1号”叶片以及“AF35”叶片的总RNA，反转录成cDNA，作为荧光定量PCR的模板，以步骤S1中设计的引物为荧光定量PCR引物，进行荧光定量PCR实验，获得荧光定量PCR数据；S3、利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对步骤S2中获得的荧光定量PCR数据进行表达稳定性分析，筛选出稳定表达的内参基因。4.根据权利要求3所述的香葱内参基因的筛选方法，其特征在于，步骤S2中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭元元，陈振东，张力，陈琴，蒋月喜，李洋，宋焕忠，车江旅，秦龙妹，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院，
类型：发明
国别省市：