一种间充质干细胞储存液制造技术

本发明专利技术公开了一种间充质干细胞储存液，所述储存液是由葡萄糖、人血清白蛋白、黄酮类化合物、肝素、亚硒酸钠、成纤维细胞生长因子和氯化钠组成的水溶液。所述储存液具体为：葡萄糖，70

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞储存液


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种间充质干细胞储存液。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是中胚层来源的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，已从肌肉、脂肪、牙周质、脐血、脐带等多种组织中分离得到。经研究证实，MSCs免疫原性较低，不易引起机体的排斥反应；具有分化成其他中胚层细胞的潜能，能够分泌多种细胞因子；具有定向迁移能力。MSCs具有的这些优良特性使之在受损组织修复、器官移植、自体免疫性疾病治疗、肿瘤治疗等方面展现出良好的应用前景。
[0003]人类间充质干细胞体外扩增第1代至第8代期间MSCs生长速度很快，以指数形式快速增值，且MSCs基因组没有显著的改变，仅有一些很低水平的单核苷酸的变化；第8代以后，扩增速度明显降低；第10代到第13代，细胞体积开始增大，核/质比变大。虽然细胞的分化潜能从第1到第13代几乎没有变化，但是在第13代的时候，17％-36％的MSCs出现了突变，而且这些突变导致了非同义氨基酸的突变，引发了一些基因的突变。而且他们发现这些基因与成骨分化、骨代谢、肿瘤发生、干细胞干性的保持等功能相关。说明MSCs在体外扩增的过程中，如果代数超过12代，就会引起MSCs产生癌变的风险。体外扩增的MSCs在临床应用上的应用最好限制在12代以内。
[0004]但是能制备间充质干细胞的医疗机构必须具备GMP(药品生产质量管理规范)合格的千级细胞层流房，这样的医疗机构毕竟是少数，所以临床上间充质干细胞的广泛应用必须解决一个远距离运输的问题。目前常用的细胞运输方式有两种，一种是非培养状态低温液氮运输，液氮冻存的细胞外送一般不能上飞机、高铁，若选择汽车，运输时间超过12小时以上液氮会完全挥发，冻存的细胞会升温死亡，同时冻存过的细胞活性会下降。另一种是培养状态下装满培养基运输，运输时间超过5小时，细胞培养液pH值会升高，细胞形态会发生变化，影响细胞分化潜能和免疫调节能力，而且细胞受污染的风险会升高。
[0005]因此，在保证储存液的成分对人体安全的情况下，如何提供一种能长时间保存MSCs的储存液，以便于MSCs的远距离储存运输，是目前本领域技术人员亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0006]鉴于现有技术中MSCs存在不便于远距离运输的问题，本专利技术提供了一种间充质干细胞储存液，所述储存液是由葡萄糖、人血清白蛋白、黄酮类化合物、肝素、亚硒酸钠、碱性成纤维细胞生长因子和氯化钠组成的水溶液。
[0007]优选的，所述储存液具体为：
[0008][0009]优选的，所述储存液具体为：
[0010][0011]本专利技术公开了一种间充质干细胞培养基，储存液是由葡萄糖、人血清白蛋白、黄酮类化合物、肝素、亚硒酸钠、成纤维细胞生长因子和氯化钠组成的水溶液，其能保持细胞的正常形态，保证了间充质干细胞临床应用的安全性和可靠性，可提高间充质干细胞的活性，促进其增殖并减少细胞凋亡，有效发挥间充质干细胞的治疗作用。
[0012]本专利技术中黄酮类化合物优选二氢槲皮素，其具有强效抗氧化性，能够抗菌抗病毒，与其他组分协同对间充质干细胞起保护作用，可显著提高间充质干细胞的存活率、抑制其调亡、降低细胞内自由基水平。
[0013]本专利技术中成纤维细胞生长因子还可维持细胞活性，在长期储存下提高细胞复苏率。
[0014]经实验证明，采用本专利技术间充质干细胞储存液保存间充质干细胞，保持成活率95％以上可达72小时，可适应长时间长距离的储存运输，运输成活率高，不影响细胞活性。
附图说明
[0015]为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0016]图1为本专利技术实施例中脐带间充质干细胞储存实验中细胞的拒染率计算结果。
具体实施方式
[0017]下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完
整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
[0018]在下述实施例中，除特殊说明以外，所用试剂均为生化级试剂，并能通过商业渠道获得。
[0019]实施例1
[0020]本实施例提供的一种间充质干细胞储存液，是将葡萄糖、人血清白蛋白、黄酮类化合物、肝素、亚硒酸钠、成纤维细胞生长因子和氯化钠添加至水中溶解制备而成，具体添加量为葡萄糖，75g/L；人血清白蛋白，43g/L；二氢槲皮素，120umol/L；肝素，0.18mol/L；亚硒酸钠，1.3g/L；成纤维细胞生长因子，0.3g/L；氯化钠，9g/L。
[0021]实施例2
[0022]本实施例提供的一种间充质干细胞储存液，是将葡萄糖、人血清白蛋白、黄酮类化合物、肝素、亚硒酸钠、成纤维细胞生长因子和氯化钠添加至水中溶解制备而成，具体添加量为葡萄糖，80g/L；人血清白蛋白，45g/L；二氢槲皮素，130umol/L；肝素，0.18mol/L；亚硒酸钠，1.4g/L；成纤维细胞生长因子，0.4g/L；氯化钠，9g/L。
[0023]下面将应用上述实施例中配制的储存液对HUC-MSCs(人脐带间充质干细胞)进行储存实验。
[0024](1)HUC-MSCs分离培养
[0025]脐带无菌条件下剪碎，常规贴壁培养法置于37℃、体积分数5％CO2和100％湿度的培养箱中，培养基含10％FBS(胎牛血清)，2mg/L表皮生长因子，2mg/L成纤维细胞生长因子，2mg/L血管内皮生长因子。培养5d后全量换液并去除浮起的组织块，培养7d时有可见细胞爬出，培养12d后去除组织块，用2.5g/L胰蛋白酶消化细胞并以5
×
105/cm2的密度传代培养，常规瑞氏染色观察形态。
[0026](2)HUC-MSCs鉴定：
[0027]取第5代细胞，用2.5g/L胰蛋白酶消化收集，将106个细胞悬浮在100μL的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)中，使用CytomicsTMFC500流式细胞仪进行细胞表面标记抗原流式鉴定，所有细胞CD73、CD90和CD105阳性表达达到95％以上，CD14、CD34、CD45、HLA-DR皆几乎不表达，表达率在0-1％(见表1)。
[0028]表1
[0029]标记抗体CD73CD90CD105CD14CD34CD45HLA-DR阳性比率(％)99.799.198.20.30.40.10.7
[0030](3)HUC-MSCs储存实验
[0031]取第5代细胞，用2.5g/L胰蛋白酶消化收集，以1...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞储存液，其特征在于，所述储存液是由葡萄糖、人血清白蛋白、黄酮类化合物、肝素、亚硒酸钠、碱性成纤维细...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晶，徐妍，
申请(专利权)人：深圳盛皓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：