糖蛋白激素长效超激动剂制造技术

本发明专利技术提供糖蛋白激素的长效、超活性类似物，其相比野生型对应物在体外和体内都显示增强的生物活性。该类似物具体地用于治疗显示低受体表达或较差的受体响应性的受试者，且用于治疗任何与糖蛋白激素活性相关的病症。治疗任何与糖蛋白激素活性相关的病症。

【技术实现步骤摘要】
糖蛋白激素长效超激动剂
[0001]本申请是中国专利技术专利申请(申请日：2013年7月29日；申请号：201380047511.2(国际申请号：PCT/US2013/052510)；专利技术名称：糖蛋白激素长效超激动剂)的分案申请。
专利

[0002]本专利技术大体涉及具有超激动剂活性的修饰糖蛋白激素，以及其在治疗与糖蛋白激素活性相关的病症中的用途。更具体地，本专利技术涉及修饰糖蛋白分子，其相比野生型α亚单位而言在α亚单位包含氨基酸取代和一个或多个插入的肽，其中该修饰分子相比野生型糖蛋白显示增强的药理学性质。

技术介绍

[0003]促性腺素促滤泡素(促卵泡激素，FSH)和绒毛膜促性腺素(CG)、促黄体激素(黄体化激素，LH)和促甲状腺素(甲状腺刺激激素，TSH)构成糖蛋白激素家族。各激素为两个非共价连接的亚单位，即α和β亚单位的杂二聚体。在相同的物种，α
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亚单位的氨基酸序列在所有激素中都相同，而β
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亚单位的序列是激素特异性的(Pierce，Ann.Rev.Biochem.50:465
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495(1981))。从鱼到哺乳动物所述亚单位的序列是高度保守的，该事实暗示这些激素都是由共同的祖先蛋白进化而来的(Fontaine，Gen.Comp.Endocrinol.32:341
‑
347(1977))。
[0004]之前关于修饰糖蛋白激素的研究已显示令人鼓舞的数据。例如，除了提供具有增加活性的修饰糖蛋白激素之外，进一步的突变已显示了受体亲和结合的增加(参见例如WO 2005/089445和WO 2005/101000)。然而，尽管亲和力增加，研究证明了修饰糖蛋白激素的清除即使不快于它们的野生型对应物，也与它们的野生型对应物一样快。为产生具有增强活性的临床有用的超激动剂，修饰糖蛋白超激动剂除了具有改善的受体结合亲和力之外，还应具有改善的生物半衰期。然而，之前进一步修饰糖蛋白激素以增加半衰期和提高生物利用度的尝试不太令人满意，且相反修饰糖蛋白激素仅证明了减弱的反应。

技术实现思路

[0005]本专利技术包括修饰糖蛋白激素，其包含的氨基酸序列在糖蛋白激素的α亚单位的Q13、E14、P16或Q20具有至少一个保守碱性氨基酸取代且在D3和Q5之间具有VNVTINVT(SEQ ID NO:20)的插入片段。
[0006]在一些实施方案中，该修饰糖蛋白激素在Q13、P16和Q20包含至少两个或至少三个碱性氨基酸取代。在一些实施方案中，该修饰糖蛋白激素还在E14包含碱性氨基酸取代。在一些实施方案中，该碱性氨基酸为精氨酸。
[0007]在一些实施方案中，所述α亚单位包含与SEQ ID NO:11具有至少85％同一性的氨基酸序列且进一步包含黄体化激素(LH)的β亚单位、绒毛膜促性腺素(CG)的β亚单位、促卵泡激素(FSH)的β亚单位或甲状腺刺激激素(TSH)的β亚单位。在一些实施方案中，所述α亚单位衍生自人α亚单位(SEQ ID NO:6)。
[0008]本专利技术包括修饰糖蛋白激素，其包含的氨基酸序列在糖蛋白激素的α亚单位的
K15、K17、K20或K24具有至少一个保守碱性氨基酸取代且在F6和T7之间具有NVTINV(SEQ ID NO:1)的插入片段。
[0009]在一些实施方案中，修饰糖蛋白激素在K15、K17、K20和K24包含至少两个、或至少三个或至少四个碱性氨基酸取代。在一些实施方案中，该修饰糖蛋白激素进一步在E18包含碱性氨基酸取代。在一些实施方案中，该碱性氨基酸为精氨酸。
[0010]在一些实施方案中，所述α亚单位包含与SEQ ID NO:7具有至少85％同一性的氨基酸序列且进一步包含黄体化激素(LH)的β亚单位、绒毛膜促性腺素(CG)的β亚单位、促卵泡激素(FSH)的β亚单位或甲状腺刺激激素(TSH)的β亚单位。在一些实施方案中，所述α亚单位衍生自牛、猪或绵羊的α亚单位(分别为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:3)。
[0011]本专利技术包括修饰糖蛋白激素，其包含的氨基酸序列在糖蛋白激素的α亚单位的K15、E18、K20或K24具有至少一个保守碱性氨基酸取代，且在F6和T7之间具有NVTINV(SEQ ID NO:1)的插入片段或具有在F6和T7之间NV的插入片段加上T7和T8之间INV的插入片段。
[0012]在一些实施方案中，修饰糖蛋白激素在K15、E18、K20和K24包含至少两个、或至少三个或至少四个碱性氨基酸取代。在一些实施方案中，所述修饰糖蛋白激素在所述α亚单位的F6和T7之间包含NVTINV(SEQ ID NO:1)的插入片段。在一些实施方案中，所述修饰糖蛋白激素包含在所述α亚单位的F6和T7之间NV的插入片段加上T7和T8之间INV的插入片段。在一些实施方案中，该碱性氨基酸为精氨酸或组氨酸。在一些实施方案中，该碱性氨基酸为精氨酸。
[0013]在一些实施方案中，所述α亚单位包含与SEQ ID NO:4具有至少85％同一性的氨基酸序列且进一步包含黄体化激素(LH)的β亚单位、绒毛膜促性腺素(CG)的β亚单位、促卵泡激素(FSH)的β亚单位或甲状腺刺激激素(TSH)的β亚单位。在一些实施方案中，所述α亚单位衍生自马的α亚单位(SEQ ID NO:4)。
[0014]本专利技术还包括刺激动物糖蛋白受体的方法，包括向动物给药上述修饰糖蛋白激素。本专利技术还包括刺激动物排卵的方法，包括向动物给药上述任一种修饰糖蛋白激素。在一些实施方案中，所述动物为人、牛、羊(sheep)、猪或马。
[0015]附图简述
[0016]图1显示用通过瞬时转染制备的所选的bFSH类似物在CHO
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FSHR细胞中的cAMP刺激。图1A显示(pFSH)、bFSH
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WT(野生型)与bFSH
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5R类似物的比较。图1B显示通过两个N
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端延伸物(ANITV，NITV)和一个内部新糖基化(V78N)(SPA cAMP测试)对hFSH
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TR4402类似物(瞬时4402)的体外生物活性的减弱。图1C显示bFSH
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5R类似物与插入片段1(5R+插入片段1)和插入片段2(5R+插入片段2)的比较。
[0017]图2A和2B显示小鼠单一皮下注射后多种bFSH类似物的PK筛选测试。在各实验中，5只小鼠用于各制备物。血样在注射后24、32和48小时采集，扣除血浆水平且数据表示为注射剂量的％(％ID)。血浆样品中FSH水平使用FSH ELISA(Endodrine Technologies)测试。
[0018]图3A
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D显示TR55601产生的不同批次(lot)的分析。图3A显示电荷异质性分析，其使用IEF然后是蛋白质印迹。批次3(泳道2和3)的次优唾液酸化作用(Suboptimal sialylation)显然不同于批次4(泳道5和6)中检测的最优高度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.修饰糖蛋白激素，其包含的氨基酸序列在糖蛋白激素的α亚单位的Q13、E14、P16和Q20具有至少一个保守碱性氨基酸取代且在D3和Q5之间具有VNVTINVT(SEQ ID NO:20)的插入片段。2.修饰糖蛋白激素，其包含的氨基酸序列在糖蛋白激素的α亚单位的K15、K17、K20和K24具有至少一个保守碱性氨基酸取代且在F6和T7之间具有NVTINV(SEQ ID NO:1)的插入片段。3.修饰糖蛋白激素，其包含的氨基酸序列在糖蛋白激素的α亚单位的K15、E18、K20和K24具有至少一个保守碱性氨基酸取代，且在F6和T7之间具有NVTINV(SEQ ID NO:1)的插入片段或具有在F6和T7之间NV的插入片段加上T7和T8之间INV的插入片段。4.一种α亚单位多肽，其选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，其中所述α亚单位多肽还包含：(A)包含至少一个提供潜在的糖基化位点的氨基酸的氨基酸插入片段,其中所述插入片段紧接在位置6、7或8之后放置，其中所述位置是相对没有任何插入或取代的野生型α亚单位测量的；和(B)所述α亚单位多肽的野生型氨基酸被碱性氨基酸的取代。5.权利要求4的α亚单位多肽，其中所述插入片段选自:(A)天冬酰胺(N)；(B)苏氨酸(T)；(C)半胱氨酸(C)；(D)天冬酰胺
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缬氨酸(NV)；(E)苏氨酸
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天冬酰胺
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缬氨酸(TNV)；(F)苏氨酸
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异亮氨酸
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天冬酰胺
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缬氨酸
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苏氨酸(TINVT)(G)天冬酰胺
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缬氨酸
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苏氨酸
‑
异亮氨酸
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天冬酰胺
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缬氨酸(NVTINV)(SEQ ID NO:l)；(H)天冬酰胺
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缬氨酸
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苏氨酸
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异亮氨酸
‑
天冬酰胺
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缬氨酸
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苏氨酸(NVTINVT)；(I)苏氨酸
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天冬酰胺
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缬氨酸
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苏氨酸
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异亮氨酸
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天冬酰胺
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缬氨酸(TNVTINV)(SEQ ID NO:12)；和(J)缬氨酸
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天冬酰胺
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缬氨酸
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苏氨酸
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异亮氨酸
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天冬酰胺
‑
缬氨酸
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苏氨酸(VNVTINVT)(SEQ ID NO:20)。6.一种α亚单位多肽，其选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，其中所述α亚单位多肽还包含:(A)提供潜在的糖基化位点的氨基酸插入片段，其中所述插入片段紧接在位置6、7或8之后放置，其中所述位置是相对没有任何插入或取代的野生型α亚单位多肽测量的,且其中所述插入片段选自：(a)天冬酰胺(N)；(b)苏氨酸(T)；(c)半胱氨酸(C)；(d)天冬酰胺
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缬氨酸(NV)；(e)苏氨酸
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天冬酰胺
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缬氨酸(TNV)；(f)苏氨酸
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异亮氨酸
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天冬酰胺
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缬氨酸
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苏氨酸(TINVT)
(g)天冬酰胺
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缬氨酸
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苏氨酸
‑
异亮氨酸
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天冬酰胺
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缬氨酸(NVTINV)(SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：M斯库德林斯基，BD温特劳布，
申请(专利权)人：特洛佛根股份有限公司，
类型：发明
国别省市：