一种在WES数据中检测单样本SMN基因拷贝数的方法技术

本发明专利技术公开了一种在WES数据中检测单样本SMN基因拷贝数的方法，通过预先使用已知SMN基因实际拷贝数的阴性样本和已知SMN基因实际拷贝数的阳性样本构建SMN1基因和SMN2基因拷贝数分值数据集来检测单个样本的基因拷贝数，通过在全外显子Bed区间内寻找与SMN基因拷贝数高相关性的对照区间；利用该区域的reads覆盖度校正不同样本间的批次效应，有效提升了检测方法的准确性，同时还可以检测出发生了g.27134T>G点突变的SMN1 2+0静默携带者。实现了精确检测单样本SMN基因拷贝数且检测出发生了g.27134T>G点突变的SMN1 2+0静默携带者的目的。目的。目的。

【技术实现步骤摘要】
一种在WES数据中检测单样本SMN基因拷贝数的方法


[0001]本专利技术涉及生物学与精准医学全基因组变异检测领域，尤其涉及一种WES(Whole Exome Sequence，全外显子组测序，简写为WES)数据中检测单样本SMN基因拷贝数的方法。

技术介绍

[0002]脊髓性肌肉萎缩症(英语：Spinal muscular atrophy，简写为SMA)，是一种遗传性神经疾病。它会造成运动神经元退化、肌肉萎缩，肌肉无力，最终造成死亡。SMA是由于人体内被称作为“运动神经元存活1号”基因(SMN1)的缺失或异常(突变)所导致的。SMA主要与两个高度同源(是指这两个基因的序列非常相似)的基因密切相关，即SMN1和SMN2(“运动神经元存活2号”基因)，这两个基因主要通过7号外显子和8号外显子上的两个基因位点进行区分。一般来说，大部分正常个体都有2份拷贝的SMN1基因与2份拷贝的SMN2基因，SMN2基因发生外显子7的跳跃，只有少量的全长SMN mRNA，所以如果某个人两份拷贝的SMN1基因都失去功能则一定会患病，只有一份SMN1基因起作用的个体为携带者。在SMN1基因都失去功能的情况下，SMN2基因拷贝数数目，则会影响患者的发病时间与疾病严重程度。
[0003]SMA基因检测的方法有以下几类：(1)PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)或一代测序，首先对目标区域进行扩增，然后通过限制性内切酶或一代测序的方法来区分，如果是患者，则在c.840位点缺失SMN1的C峰，只显示SMN2的T纯合峰；正常人或携带者应该为杂合的C/T峰。(2)MLPA，多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)于2002年由Schouten等首先报道，是早年几年发展起来的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测45个核苷酸序列拷贝数的改变，针对c.840C>T位点设计不同的探针序列，对SMN1基因和SMN2基因扩增出不同长度的片段，而峰的高度可以反映拷贝数变异。(3)二代测序：贝勒医学院的Feng等人在Genetics in Medicine杂志上发表了一项利用二代测序检测SMA的研究(pmid：28125085)，该研究包括6648例样本。主要的原理是收集同一批次样本进行SMN基因的目标区域捕获测序，统计SMN1与SMN2各个的exon1
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exon8的总覆盖度，且提取的是单端reads，然后根据c.840C>T分析SMN1 reads与SMN2 reads比例，再根据SMN1及SMN2 reads比例、总覆盖度计算出每个人分别携带几个拷贝的SMN1与SMN2。与MLPA相比，灵敏度大于98％，特异性大于98％。另外该研究还确诊了几个致病点突变位点，并且g.27134T>G与RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性内切酶片段长度多态性)结果一致，该位点与SMN1 2+0型特殊携带者密切相关。但是对于SMN2拷贝数的灵敏度与特异性未明确描述。
[0004]针对上述3种检测方法，每种方法都有各自的不足，如(1)PCR-RFLP或一代测序：这个方法的缺陷是存在酶切不彻底的隐患，且不能区分携带者与正常人，也不能检测SMN2拷贝数，在临床上可以诊断SMN1纯合缺失的患者，其他情况只能作为初筛。(2)MLPA技术该试剂盒不能检测点突变与特殊的SMN1 2+0携带者，且检测通量低。(3)Feng等人的检测方法是基于NGS平台，虽然能够解决特殊的SMN1 2+0携带者变异，但是该方法需要在同批次样本中
检测以消除批次效应，如果同批次样本数量不足够多，会对检测结果产生影响。该方法中提取单端reads的比对结果统计覆盖度，会丢失部分有效信息。该方法统计了exon1
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exon8的所有外显子上的覆盖度，虽然全面考察了SMN基因的比对情况，但是由于文库制备和测序环节的不确定性，多个外显子间的扩增效率有差异，导致扩增出来的reads会有差异，对检测SMN基因的拷贝数，尤其是exon7和exon8的真实拷贝数有较大影响。
[0005]此外，部分开源软件可以在WGS中检测SMN基因拷贝数，但是这些软件要么需要使用WGS数据，要么需要批次的样本，并不能有效解决单样本检测的需求。为了能够快速精确的检测SMN基因拷贝数，尤其是能够满足临床上需要对单个样本的检测，本专利技术基于NGS平台和WES测序数据，利用大量测试样本构建数据集，预先探究SMN基因不同拷贝数对应的概率值，充分消除样本间的批次效应，增加检测的灵活性和可靠性。

技术实现思路

[0006]本申请通过提供一种在WES数据中检测单样本SMN基因拷贝数的方法，用于解决现有技术中不能精确检测单样本SMN基因拷贝数且不能同时检测出特殊的SMN1 2+0携带者状态的问题。
[0007]本申请提供了一种在WES数据中检测单样本SMN基因拷贝数的方法，
[0008]S1、收集不同批次WES数据的已知SMN基因实际拷贝数的阴性样本和已知SMN基因实际拷贝数的阳性样本，在全外显子Bed区间内寻找与SMN基因拷贝数高相关性的对照区间；
[0009]S2、利用所述对照区间的resds覆盖度校正不同批次的所述阴性样本和阳性样本间的批次效应，定义所述不同批次WES数据的已知SMN基因实际拷贝数的阴性样本和已知SMN基因实际拷贝数的阳性样本为所有样本，计算所述所有样本的SMN1基因的相应拷贝数时的P1值分布范围和SMN2基因的相应拷贝数时的P2值分布范围：
①
SMN1基因的P1值分布范围是根据样本中SMN1基因的实际拷贝数进行分组的，例如样本SMN1基因的实际拷贝数为0个拷贝的P1值分布范围定义为P1_zero、样本SMN1基因的实际拷贝数为1个拷贝的P1值分布范围定义为P1_one、样本SMN1基因的实际拷贝数为2个拷贝的P1值分布范围定义为P1_two，以此类推。
②
SMN2基因的P2值分布范围是根据样本中SMN2基因的实际拷贝数进行分组的，例如样本SMN2基因的实际拷贝数为0个拷贝的P2值分布范围定义为P2_zero、样本SMN2基因的实际拷贝数为1个拷贝的P2值分布范围定义为P2_one、样本SMN2基因的实际拷贝数为2个拷贝的P2值分布范围定义为P2_two，以此类推。以下把P1_zero、P1_one、P1_two、P2_zero、P2_one、P2_two等统称为P1值和P2值。
[0010]统计所述所有样本中已经验证为是静默携带者的样本的7号内含子的g.27134T>G位点的校正后覆盖度P_silent值分布范围，后期可以根据该覆盖度P_silent值分布范围和单个样本的SMN1基因的拷贝数为2的证据，判断单样本是否为静默携带者；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在WES数据中检测单样本SMN基因拷贝数的方法，其特征在于：S1、收集不同批次WES数据的已知SMN基因实际拷贝数的阴性样本和已知SMN基因实际拷贝数的阳性样本，在全外显子Bed区间内寻找与SMN基因拷贝数高相关性的对照区间；S2、利用所述对照区间的resds覆盖度校正所述阴性样本和阳性样本间的批次效应，定义所述不同批次WES数据的已知SMN基因实际拷贝数的阴性样本和已知SMN基因实际拷贝数的阳性样本为所有样本，计算所述所有样本的SMN1基因的相应拷贝数时的P1值分布范围和SMN2基因的相应拷贝数时的P2值分布范围；统计所述所有样本中已经验证为是静默携带者的样本的7号内含子的g.27134T>G位点的校正后覆盖度P_silent值分布范围；S3、计算单个测试样本的SMN1基因的7号外显子和8号外显子的p1值、SMN2基因的7号外显子和8号外显子的p2值，根据S2中计算所得的P1值和P2值的分布范围判断本步骤中p1值和p2值所对应的SMN1基因和SMN2基因的拷贝数；统计单个测试样本的7号内含子上的g.27134T>G位点的覆盖度p_silent值；根据所述p_silent值和所述单个测试样本的SMN1基因的拷贝数，判断该单个测试样本静默携带者的状态：当p_silent值在S2中计算的P_silent值分布范围内且所述单个测试样本的SMN1基因的拷贝数是2时，判断所述单个测试样本为静默携带者；当p_silent值在S2中计算的P_silent值分布范围内但所述单个测试样本的SMN1基因的拷贝数不是2，判断所述单个测试样本为疑似静默携带者；其他情况时均判断所述单个测试样本为非静默携带者。2.如权利要求1所述的在WES数据中检测单样本SMN基因拷贝数的方法，其特征在于：所述S1中寻找所述对照区间的步骤包括：S101、用MLPA平台验证所述所有样本的SMN1基因和SMN2基因的实际拷贝数，使用生信分析流程进行处理后得到Bam文件；S102、预先筛选出两拷贝基因的Bed区间，统计所述所有样本在全外显子组的Bed区间内的覆盖度；S103、把所述所有样本的覆盖度校正到100X，得到样本校正后覆盖度；S104、根据所述所有样本校正后覆盖度计算相关性和方差，查找相关性好且方差值低的Bed区间作为对照区间。3.如权利要求2所述的在WES数据中检测单样本SMN基因拷贝数的方法，其特征在于：所述对照区间为相关性好且方差值低的前5个Bed区间。4.如权利要求3所述的在WES数据中检测单样本SMN基因拷贝数的方法，其特征在于：所述S2的步骤包括：S201、统计所述所有样本在SMN1基因和SMN2基因的7号外显子和8号外显子的总覆盖度并校正，得到SMN1基因和SMN2基因7号外显子和8号外显子的校正后总覆盖度；S202、统计所述所有样本在5个所述对照区间的总覆盖度并校正，得到对照区间的校正覆盖度均值；S203、统计所述所有样本的3个点突变的覆盖度并校正，得到3个点突变的校正后覆盖度；所述3个点突变的覆盖度包括7号外显子上的c.840C>T位点的覆盖度、8号外显子上的
c.*239G>A位点的覆盖度和7号内含子上的g.27134T>G位点的覆盖度；计算SMN1基因的校正后覆盖度在7号外显子、8号外显子的ratio值；计算SMN2基因的的校正后覆盖度在7号外显子、8号外显子的ratio值；S204、根据所述SMN1基因和SMN2基因的7号外显子和8号外显子的校正后总覆盖度、对照区间的校正覆盖度均值、所述ratio值，计算SMN1基因的7号外显子的拷贝数p_e7_s1值和8号外显子的拷贝数p_e8_s1值；计算SMN2基因的7号外显子的拷贝数p_e7_s2值和8号外显子的拷贝数p_e8_s2值；根据p_e7_s1值和p_e8_s1值计算p1值；根据p_e7_s2值和p_e8_s2值计算p2值；所述所有样本根据相应拷贝数统计的p1值的分布范围为P1，所述所有样本根据相应拷贝数统计的p2值的分布范围为P2。5.如权利要求4所述的在WES数据中检测单样本SMN基因拷贝数的方法，其特征在于：所述校正均采用对应的批次内中位数覆盖度进行校正。6.如权利要求5所述的在WES数据中检测单样本SMN基因拷贝数的方法，其特征在于：先计算所述所有样本中每个样本的p1值和p2值，再根据相应拷贝数统计所述所有样本的P1值和P2值；计算方法如下：SMN1基因在7号外显子上的ratio值和p_e7_s1值的计算公式为：ratio_e7_s1＝rc_e7_s1/(rc_e7_s1+rc_e7_s2)；cn_e7_s1＝rc_e7_s1_total/rc_control；cn_e7_s2＝rc_e7_s2_total/rc_control；p_e7_s1＝ratio_e7_s1*(cn_e7_s1+cn_e7_s2)*2；SMN1基因在8号外显子上的ratio值和p_e8_s1值的计算公式为：ratio_e8_s1＝rc_e8_s1/(rc_e8_s1+rc_e8_s2)；cn_e8_s1＝rc_e8_s1_total/rc_control；cn_e8_s2＝rc_e8_s2_total/rc_control；p_e8_s1＝ratio_e8_s1...

【专利技术属性】
技术研发人员：余伟师，梁萌萌，鲍远亮，栗海波，贺洪鑫，
申请(专利权)人：赛福解码北京基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：