一种新型检测Hg制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性汞离子荧光分子探针的制备方法及其在环境和生物体内的应用，其化学结构式如下：本发明专利技术提供的荧光分子探针具有水溶性好、响应快速、特异性高的优点，能够避免其他金属离子的干扰，有利于环境中Hg

【技术实现步骤摘要】
一种新型检测Hg
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的荧光分子探针的制备方法及其在环境和生物体内的应用


[0001]本专利技术属于分析化学
，涉及一种新型检测Hg
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的荧光分子探针的制备方法及其在环境和生物体内的应用。

技术介绍

[0002]汞（Mercury, Hg）是毒性最强的重金属污染物之一，广泛存在于水、空气和土壤中，据美国环境保护署（EPA）报道，每年全球汞排放总量达到近7500吨。在自然界，汞主要以零价汞、无机汞和有机汞3种形式存在。其中，环境中的汞可以通过食物链进入生物体内，与蛋白质分子中的巯基(-SH)结合形成不易降解的巯醇盐，在动物和人体内积累和富集，从而造成慢性中毒，最终引起以神经损害为主的多种疾病，如日本的水俣病。因此，开发一种高灵敏度、高特异性的快速检测方法，以实现对环境和生物体内汞离子的常规检测，具有非常重要的意义。
[0003]目前，包括电化学法、原子吸收光谱法、等离子体发射光谱法(ICP)、气相色谱法等多种传统检测方法均可实现环境中Hg
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的检测和分析，且具有测定准确、测量范围广等优势。然而这些技术一般需要复杂的样品前处理步骤以及高成本的实验仪器，且无法进行实时监测，因此不适用于生物环境中Hg
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的检测，严重制约了这些技术的大规模应用。
[0004]基于荧光探针的荧光光谱法具有灵敏度高、特异性好、响应速度快、操作简单、实时检测等优点，近年来成为研究热点被广泛应用于环境、食品和医药等领域中。Shiraishi课题组报道了一个基于香豆素荧光母核的荧光分子探针，可实现pH=2-12的水性溶液中Hg
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的特异性检测。由基于分子内电荷转移效应（intramolecular charge transfer，ICT），该探针在乙腈：水=1:1的水性溶液中呈现较强的蓝色荧光（最大激发波长为445 nm），而加入Hg
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之后，ICT效应减弱，导致445 nm荧光强度逐渐减弱，从而通过荧光淬灭定量检测Hg
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含量(Shiraishi Y, Sumiya S, Hirai T, A coumarin-thiourea conjugate as a fluorescent probe for Hg(II) in aqueous media with a broad pH range 2-12. Org. Biomol. Chem., 2010, 8(6): 1310-4. )。该探针虽然具有特异性好、pH稳定性强等优势，但是由于Hg
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本身是重金属离子，可能会造成荧光淬灭，故荧光淬灭型分子探针在检测时易受到多种因素干扰，准确性较差。因此荧光增强型探针更适用于Hg
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的检测。CN 102268249 B报道了一个具有专一识别效果和良好灵敏度的Hg
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荧光分子探针，向探针溶液中Hg
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后，560 nm处的黄色荧光强度随Hg
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浓度增加而增强，具有良好的线性关系，可实现定量检测，且能够检测出浓度大于0.1 μM的Hg
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。但该探针的水溶性较差，且发射波长较短，难以实现水质环境和生物环境中Hg
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的检测。相比于短波长发射光，长波长发射光在生物体内可减少生物样品的光损伤，且具有更强的组织渗透能力以及更少的背景荧光干扰，因此具有更好的应用前景。可见，开发一个具有高灵敏度、高特异性、水溶性好的红光发射荧光分子探针，对实现环境和生物体内汞离子的常规检测，具有非常重要的意义。

技术实现思路

[0005]针对现有Hg
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荧光分子探针存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种水溶性好、特异性高，且具有红光发射的Hg
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荧光分子探针。
[0006]本专利技术的第二个目的在于提供上述荧光分子探针的高效制备方法。
[0007]本专利技术的第三个目的在于提供上述荧光分子探针在水溶液和生物体内Hg
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的检测应用。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术提供了一种荧光分子探针，具有式I结构：式I所述荧光探针的制备方法优选为：以4-溴-1,8-萘二甲酸酐、正己胺为原料，在无水乙醇中120℃下加热回流，反应完成后，倒入冰水中，抽滤洗涤沉淀物，柱层析干燥后可得淡黄色粉末。将其溶解于DMSO中，并加入N-羟基琥珀酰亚胺和无水碳酸钾，搅拌均匀，90 o
C下加热回流至反应完全后，冷却至室温，倒入冰水中并用稀HCl溶液调节pH至近中性，乙酸乙酯萃取、干燥后硅胶柱层析纯化。将纯化后的产物溶解于三氟乙酸中，加入六次甲基四胺，90 o
C下加热回流至反应完全后，冷却至室温，逐滴滴入冰水中并用稀NaOH溶液调节pH至近中性，抽滤、干燥后硅胶柱层析纯化。将纯化后的产物溶于乙醇中，加入2-甲基吡啶盐和1滴哌啶，40 o
C下水浴加热回流，待反应完成后，真空浓缩，并用硅胶柱层析分离纯化。在氮气保护环境下，将纯化后的产物溶解于DMF溶液中，向体系分批次加入K2CO3和1，2-二溴乙烷，置于80℃加热反应至完全后，倒入冰水中，并用乙酸乙酯溶液萃取。合并有机层，分别用水、NaCl溶液洗涤后，用无水Na2SO4干燥，减压蒸干溶剂，硅胶柱层析纯化。将纯化后的产物和叔丁醇钾溶解于DMSO溶液中，加入常温下搅拌至反应完全，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，分别用水、NaCl溶液洗涤后，无水Na2SO4干燥，减压蒸干溶剂，硅胶柱层析纯化，即可得到目标分子探针。
[0009]本专利技术的合成如下所示：
本专利技术提供了一种所述荧光探针的应用，可应用于环境和生物体内Hg
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的定量检测，检测原理为：利用乙烯基阻碍探针的ICT作用，使得探针只能发出较弱荧光，而与Hg
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反应后，羟基得以恢复，ICT作用恢复，使得探针在597 nm处荧光显著增强，最终实现了对Hg
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的定量检测。检测机理如图所示：本专利技术提供了一种所述荧光探针测定Hg
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的方法。具体测定方法是：在室温条件下，所述荧光探针溶解于PBS缓冲溶液（10 mM，pH=7.4）中，将其配置成浓度为5 μM-20 μM。向体系中加入不同浓度的HgCl2水溶液，分别测定荧光强度，通过荧光强度与Hg
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浓度的线性关系实现对Hg
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的定量检测。
[0010]上述检测方法，优选的，溶剂体系为PBS缓冲溶液。
[0011]上述检测方法，优选的，pH为7.4。
[0012]上述检测方法，优选的，荧光探针浓度为10 μM。
[0013]本专利技术所述荧光探针可以应用于细胞内Hg
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的检测。具体检测方法为：在HeLa培养基中加入10 μM的荧光探针溶液，置于 37 o
C，5 %的CO2下在培养箱中孵育30分钟后，用0.1 M的PBS 缓冲液（10 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可用于特异性识别Hg
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的荧光分子探针，其特征在于，具有式（I）所示的结构：式I。2.权利要求1所述荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤包含以下几个步骤：（1）称取4-溴-1,8-萘二甲酸酐和正己胺溶解于无水乙醇中，120℃加热回流反应，TLC监测至完全反应后，将体系倒入冰水中，有黄色絮状物析出，抽滤并收集、洗涤滤饼，干燥后硅胶柱层析纯化，旋蒸除去溶剂后得到淡黄色粉末化合物1，所述化合物1的结构式如下：;(2)将化合物1溶于适量DMSO溶液中，分别加入N-羟基琥珀酰亚胺和无水碳酸钾，90℃下加热回流，TLC监测至完全反应后，将体系倒入冰水中，用稀HCl溶液调节pH至6~7，用乙酸乙酯溶液萃取，合并有机层，干燥后硅胶柱层析纯化，旋蒸除去溶剂后得到淡黄色固体化合物2，所述化合物2的结构式如下：;(3)将化合物2和六次甲基四胺溶于适量三氟乙酸中，90℃回流反应，TLC监测至完全反应
’
将体系倒入冰水中，用NaOH溶液调节pH至6~7，抽滤、干燥后，硅胶柱层析纯化，旋蒸除去溶剂后得到黄色固体化合物3，所述化合物3的结构式如下：；（4）称取化合物3和2-甲基吡啶盐溶于无水乙醇中，并加入1滴哌啶，40℃水浴反应至完全，将体系减压蒸干，硅胶柱层析纯化，减压蒸干溶剂，得到紫红色固体粉末化合物4，所述
化合物4的结构式如下：；（5）在氮气保护环境下，将化合物4溶解于DMF溶液中，向体系分批次加入K2CO3和1，2-二溴乙烷，将体系置于80℃加热反应至完全后，倒入冰水中，并用乙酸乙酯溶液萃取；合并有机层，分别用水、NaCl溶液洗涤后，用无水Na2SO4干燥，减压蒸干溶剂，硅...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ五一IntClC零七D四零一零六，
申请(专利权)人：湖南超亟化学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：