用于基于大小回收稀有细胞的以柱为基础的装置和方法，及其用途制造方法及图纸

公开了一种用于回收目的细胞的以柱为基础的装置和方法。所述装置包括柱，所述柱包括：(i)界定内腔室的内壁，所述内腔室具有入口开口和出口开口，(ii)邻近出口开口安置的穿孔塞，(iii)具有通道并且安置在腔室内并且邻近穿孔塞的套筒插入物，和(iv)容纳在套筒插入物内并且被夹在两个密封装置中间的过滤装置。具体来说，可以使用所公开的装置回收肿瘤来源的内皮细胞簇(TECC)，其特征在于具有多个核，表达内皮标志物(PECAM1、VWF和CDH5)以及不表达白细胞、巨核细胞和血小板标志物。还涵盖了通过使用要求保护的装置检测从血液样品分离的TECC的存在而用于癌症的诊断和预后的方法、试剂和试剂盒。剂和试剂盒。剂和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
用于基于大小回收稀有细胞的以柱为基础的装置和方法，及其用途
[0001]本申请为一项专利技术专利申请的分案申请，其母案的申请日为2016年1月21 日、申请号为201680014812.9、专利技术名称为“用于基于大小回收稀有细胞的以柱为基础的装置和方法，及其用途”。
[0002]相关申请的引用
[0003]本申请要求2015年1月21日提交的新加坡临时申请第10201500471Q和 10201500472R号的优先权，其内容以引用方式全部并入本文中以用于所有目的。


[0004]本专利技术涉及一种用于回收目的细胞、尤其是稀有细胞的装置和方法。本专利技术还涉及使用所公开的装置和方法回收的细胞，和所述细胞作为生物标志物用于癌症诊断和预后的用途。

技术介绍

[0005]对于疾病状态例如癌症的精确诊断来说，稀有细胞例如患病细胞的检测和回收正变得越来越重要。癌症是全球范围内第二大死因，2012年造成820万人死亡。如果被早期检测到和治疗的话，癌症死亡率可以显著降低。然而，用于可靠地早期检测癌症的方法主要包括使用内窥镜检查或放射性扫描，这是高成本的并且对患者造成特定健康风险。
[0006]当前可获得的用于分离和检测细胞的大多数装置只聚焦于捕获细胞(例如使用过滤筛)，但没有回收被捕获到的细胞。这导致被捕获到的细胞的随后分析仅限于筛上表征，例如使用免疫组织化学染色。使用此类装置，对于目的单细胞的更复杂分析(例如DNA突变分析或基因表达分析)是不可行的。当前可获得的用于分离稀有细胞的装置和方法存在缺陷，即需要额外步骤(使用繁琐技术，例如激光解剖显微镜)来分离粘附在滤器上的细胞。实际上，使用可获得的微过滤装置分离的稀有细胞容易粘附到滤器或装置的其他组件上，这对回收效率造成负面影响或甚至阻碍任何细胞被回收以用于下游分析。
[0007]因此，需要提供一种用于有效捕获和回收细胞、尤其是稀有细胞的装置和方法，其克服或至少改善以上所述的一个或多个缺点。需要以稀有细胞不粘附到装置的组件和滤器上的方式优化使用方法、材料和/或装置配置来优化回收分离稀有细胞的效率，使得稀有细胞可以被容易且有效地回收以用于下游程序。
[0008]需要提供用于癌症早期检测的侵入性更小的筛选测试方法。

技术实现思路

[0009]在第一方面，提供一种用于从样品捕获和回收细胞的设备，其包括至少一个柱，所述柱包括：
[0010](i)界定内腔室的内壁，所述内腔室在柱的第一端具有用于接收样品的入口开口，并且在柱的第二端具有出口开口；
[0011](ii)在内腔室内部邻近柱的第二端配置的穿孔塞；
[0012](iii)在第一端具有开口并且在第二端具有开口的套筒插入物，所述套筒插入物包括在第二端逐渐变细的通道并且安置在内腔室内，其第二端邻近穿孔塞；和
[0013](iv)容纳在套筒插入物内的过滤部件，所述过滤部件包括夹在两个密封装置中间的筛。
[0014]在第二方面，提供一种用于从样品捕获和回收细胞的方法，其包括以下步骤：
[0015](a)将样品引入本文所述的设备的入口开口以允许样品流过设备的套筒插入物和过滤部件；和
[0016](b)收集在设备的过滤部件中的筛的表面上保留的残余物。
[0017]在第三方面，提供一种具有以下特征的分离细胞群体：
[0018](i)是来源于肿瘤并且分离自血液的内皮细胞；
[0019](ii)每个细胞都具有至少两个明显区别的核；
[0020](iii)每个细胞都具有大于约10μm的主轴；
[0021](iv)表达内皮细胞基因或蛋白质；
[0022](v)不表达白细胞特异性基因或蛋白质；和
[0023](vi)不表达巨核细胞或血小板特异性基因或蛋白质。
[0024]在第四方面，提供一种在受试者的样品中检测本文所述的分离细胞群体的方法，所述方法包括：
[0025](a)使用本文所述的设备或本文所述的方法从样品捕获和回收细胞。
[0026]在一个实施方案中，第四方面的方法另外包括以下步骤：
[0027](b)将来自步骤(a)的细胞与偶合到可检测标记上的至少一个抗体接触以允许所述抗体结合到在所述细胞上表达的一个或多个目标生物标志物；
[0028](c)从所述样品中去除未结合的抗体；和
[0029](d)检测和分析结合到所述抗体的所述可检测标记以检测所述分离细胞群体。
[0030]在另一个实施方案中，第四方面的方法另外包括以下步骤：
[0031](b)裂解来自步骤(a)的细胞；
[0032](c)将来自步骤(b)的裂解细胞样品与来自第一引物对的反向引物以及反转录酶接触以实现RNA反转录成cDNA，所述来自第一引物对的反向引物被导向目标RNA区域；
[0033](d)随后使来自步骤(c)的样品与以下物质接触：
[0034](i)来自第一引物对的正向引物，所述来自第一引物对的正向引物被导向目标cDNA区域，
[0035](ii)来自第二引物对的反向引物和正向引物，所述来自第二引物对的反向引物和正向引物被导向目标DNA区域，和
[0036](iii)DNA聚合酶，
[0037]以在预扩增步骤中同时扩增目标cDNA区域和目标DNA区域；和
[0038](e)分析扩增的目标cDNA区域和/或扩增的目标DNA区域。
[0039]在一个实施方案中，第四方面的方法另外包括：使来自步骤(d)的样品经历半巢式PCR，所述半巢式PCR使用步骤(c)中的反向引物或步骤(d)(i)中的正向引物，和在扩增的目标cDNA区域内部结合的巢式引物。
[0040]在另外一个实施方案中，第四方面的方法另外包括：使来自步骤(d)的样品经历巢式PCR，所述巢式PCR使用在扩增的目标DNA区域内部结合的巢式引物对。
[0041]在第五方面，提供一种用于在受试者的样品中检测第三方面的分离细胞群体的方法，所述方法包括：
[0042](a)将来自所述样品的细胞与偶合到可检测标记上的至少一个抗体接触以允许所述抗体结合到在所述细胞上表达的一个或多个目标生物标志物；
[0043](b)从所述样品中去除未结合的抗体；和
[0044](c)检测和分析结合到所述抗体的所述可检测标记以检测所述分离细胞群体。
[0045]在第六方面，提供一种用于在受试者的样品中检测第三方面的分离细胞群体的方法，所述方法包括：
[0046](a)裂解所述样品中存在的细胞；
[0047](b)将来自步骤(a)的裂解细胞样品与来自第一引物对的反向引物以及反转录酶接触，以实现RNA反转录成cDNA，所述来自第一引物对的反向引物被导向目标RNA区域；
[0048](c)随后将来自步骤(b)的样品与以下物质接触：
[0049](i)来自所述第一引物对的正向引物，所述来自第一引物对的正向引物被导向目标cDNA区域，
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于从样品捕获和回收细胞的设备，其包括至少一个柱，所述柱包括：(i)界定内腔室的内壁，所述内腔室在所述柱的第一端具有用于接收所述样品的入口开口，并且在所述柱的第二端具有出口开口；(ii)在所述内腔室内部邻近所述柱的所述第二端安置的穿孔塞；(iii)在第一端具有开口并且在第二端具有开口的套筒插入物，所述套筒插入物包括在所述第二端逐渐变细的通道并且安置在所述内腔室内，其第二端邻近所述穿孔塞；和(iv)容纳在所述套筒插入物内的过滤部件，所述过滤部件包括夹在两个密封部件中间的筛。2.根据权利要求1所述的设备，其包括一个柱，或者两个或更多个柱；其中，任选地，所述柱的所述第二端适于连接到一个或多个泵，所述泵用于控制通过所述柱的所述样品的流动速率，其中，任选地，所述泵适于在选自由以下组成的组的流动速率下传递所述样品：至少约0.05mL/min、至少约0.10mL/min、至少约0.15mL/min、至少约0.20mL/min、至少约0.25mL/min、至少约0.30mL/min、至少约0.40mL/min和至少约0.50mL/min；其中，任选地，所述筛包括非细胞粘附性材料，其中，任选地，所述非细胞粘附性材料选自由硅、二氧化硅、氮化硅、基于环氧基的负型光刻胶和陶瓷组成的组，其中，任选地，所述基于环氧基的负型光刻胶包括SU-8，以及其中，任选地，所述筛包括多个孔，所述孔的直径选自由以下组成的组：至少约6μm、至少约7μm、至少约8μm、至少约9μm、至少约10μm、至少约12μm、至少约14μm、至少约16μm、至少约18μm和至少约20μm。3.一种用于从样品捕获和回收细胞的方法，其包括以下步骤：(a)将所述样品引入根据权利要求1或2所述的设备的所述入口开口以允许所述样品流过所述设备的所述套筒插入物和过滤部件；和(b)收集在所述设备的所述过滤部件中的所述筛的表面上保留的残余物。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述样品包括生物流体，任选地，所述生物流体选自由以下组成的组：全血、血清、血浆、脑脊髓液、淋巴液、囊液、痰、粪便、胸腔积液、黏液、腹水和尿，其中，任选地，所述样品包括单细胞，任选地，所述单细胞选自由疑似癌细胞、疑似肿瘤来源细胞、疑似来源于胚胎或胎儿的细胞、和来自病原生物体的细胞组成的组；或者所述样品包括多个细胞，其中所述多个细胞中的至少一些任选地选自由以下组成的组：疑似癌细胞、疑似肿瘤来源细胞、疑似来源于胚胎或胎儿的细胞、和来自病原生物体的细胞；其中，任选地，所述多个细胞中的两个或更多个形成细胞簇；其中，任选地，所述单细胞或所述多个细胞中的至少一些是多核的；其中，任选地，所述样品是血液样品，且从其捕获和回收的细胞包括至少两个明显区别的核，其中，任选地，所述细胞的主轴是至少10μm；
其中，任选地，所述细胞表达选自由PECAM1、VWF和CDH5组成的组的基因；其中，任选地，所述细胞不表达选自由PTPRC、ITGA2B和GP1BA组成的组的基因；以及其中，任选地，收集步骤(b)中的所述残余物包括使用移液管回收所述残余物。5.一种用于在受试者的样品中检测具有以下特征的分离细胞群体的方法，(i)是来源于肿瘤并且分离自血液的内皮细胞；(ii)每个细胞都具有至少两个明显区别的核；(iii)每个细胞都具有大于约10μm的主轴；(iv)表达内皮细胞基因或蛋白质；(v)不表达白细胞特异性基因或蛋白质；和(vi)不表达巨核细胞或血小板特异性基因或蛋白质；所述方法包括：(a)使用根据权利要求1或2所述的设备或根据权利要求3或4所述的方法从所述样品捕获和回收所述细胞。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述分离细胞群体的内皮细胞基因选自由PECAM1、VWF和CDH5组成的组；并且其中，任选地，所述白细胞特异性基因和巨核细胞特异性基因或血小板特异性基因选自由PTPRC、ITGA2B和GP1BA组成的组。7.根据权利要求5或6所述的方法，其进一步包括以下步骤：(b)使来自步骤(a)的细胞与偶合到可检测标记上的至少一个抗体接触以允许所述抗体结合到在所述细胞上表达的一个或多个目标生物标志物；(c)从所述样品去除未结合的抗体；和(d)检测和分析结合到所述抗体的所述可检测标记以检测所述分离细胞群体。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述抗体能够特异性结合到选自由以下组成的组的目标生物标志物：PAI-1、波形蛋白、FOXC1、角蛋白-8、角蛋白-18、角蛋白-19、Ep-CAM、CD45、VWF、PECAM-1、CD146、CD41、CD34、PSMA、CD105、CD309、CD144、CD202B和血管生成素2；以及其中，任选地，所述可检测标记选自由荧光基团、放射性同位素、稳定同位素、酶基团、化学发光基团和生物素基基团组成的组。9.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括以下步骤：(b)裂解来自步骤(a)的细胞；(c)使来自步骤(b)的裂解细胞样品与来自第一引物对的反向引物以及反转录酶接触，以实现RNA反转录成cDNA，来自所述第一引物对的所述反向引物被导向目标RNA区域；(d)随后使来自步骤(c)的样品与以下物质接触：(i)来自所述第一引物对的正向引物，来自所述第一引物对的所述正向引物被导向目标cDNA区域，(ii)来自第二引物对的反向引物和正向引物，来自所述第二引物对的所述反向引物和正向引物被导向目标DNA区域，和(iii)DNA聚合酶，以在预扩增步骤中同时扩增所述目标cDNA区域和所述目标DNA区域；和
(e)分析扩增的目标cDNA区域和/或扩增的目标DNA区域。10.根据权利要求9所述的方法，其另外包括：使来自步骤(d)的样品经历半巢式PCR，所述半巢式PCR使用步骤(c)中的所述反向引物或步骤(d)(i)中的所述正向引物，和在扩增的目标cDNA区域内部结合的巢式引物，或使来自步骤(d)的样品经历巢式PCR，所述巢式PCR使用在扩增的目标DNA区域内部结合的巢式引物对；其中，任选地，步骤(c)和(d)在同一个反应混合物中进行；其中，任选地，步骤(e)中的分析包括分析扩增的目标cDNA的基因表达；并且其中，任选地，步骤(e)中的分析包括分析扩增的目标cDNA的突变。11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述第一引物对或所述第二引物对选自由以下组成的组：(i)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；(ii)SEQ ID NO:3和...

【专利技术属性】
技术研发人员：应仪如，陈民汉，李玉山，I，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：