一种调控N-乙酰神经氨酸产量提高的重组枯草芽孢杆菌制造技术

本发明专利技术公开了一种调控N

【技术实现步骤摘要】
一种调控N-乙酰神经氨酸产量提高的重组枯草芽孢杆菌


[0001]本专利技术涉及一种调控N-乙酰神经氨酸产量提高的重组枯草芽孢杆菌，属于枯草芽孢杆菌代谢工程和基因工程


技术介绍

[0002]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在工业上应用十分广泛，在生产蛋白和高附加值化合物的生产上具有非常重要的地位。同时，它是一种非致病微生物，已经被美国食品和药物管理局(FDA)认可为安全的(GRAS)食品级微生物。此外，枯草芽孢杆菌具有许多优点，包括：细胞生长速率快，发酵培养时间短，培养条件要求低，易于进行代谢工程改造，分泌蛋白质能力强等。N-乙酰神经氨酸(NeuAc)又名唾液酸，燕窝酸，是一种重要的营养添加剂和药物中间体，在促进婴儿大脑发育，维持大脑健康和增强免疫力方面发挥着关键作用。
[0003]目前虽然在代谢工程改造中已有很多策略用于改善目标产物的生物合成，比如酶活性和表达水平优化、阻断竞争途径、中心代谢流重构等，但是这些策略都没有考虑到单细胞水平上生物合成能力的差异。随着单细胞检测技术的发展，研究表明由一个单克隆细胞发展而来的群体存在异质性，即在发酵过程中存在生产亚群、非生产亚群等。生产亚群因生产负担常常表现为降低的适应能力，然而，非生产亚群消耗营养物质却不能高效合成目标产物，可能将更多的营养物质用于生长，因此更加具有生长优势。因此，在发酵过程中，生产亚群会非生产细胞亚群所占的比例会逐步增加，从而占据整个生物反应器，降低产物合成的综合效率。目前还未有利用细胞自身的异质性改善枯草芽孢杆菌生物合成的先例。因此，此株高产NeuAc枯草芽孢杆菌菌株的构建不仅为高附加值化合物NeuAc发酵法大规模生产奠定了基础，还为枯草芽孢杆菌的代谢工程改造提供新的有效方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种调控重组枯草芽孢杆菌N-乙酰神经氨酸产量提高的方法。本专利技术利用可以正向响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器调控必需基因表达，构建一种细胞亚群调控回路，偶联生长与合成，从而赋予高产细胞亚群生长优势，提高其在发酵过程中所占的比例而提高NeuAc的产量。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供细胞亚群调控回路，含有响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器和必需基因；
[0006]所述响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器包括：IPTG诱导型启动子P
grac2
、转录调控蛋白nanR的编码基因、整合有转录调控蛋白nanR结合序列的组成型启动子P
veg105
、必需基因；所述IPTG诱导型启动子P
grac2
调控转录调控蛋白nanR表达；所述启动子P
veg105
调控必需基因表达；所述启动子P
grac2
和P
veg105
转录方向相反；
[0007]所述必需基因包括但不限于二氢蝶呤醛缩酶基因folB和SEDS家族肽聚糖糖基转移酶基因ftsW。
[0008]在一种实施方式中，所述细胞亚群调控回路还含有阻遏蛋白lac I表达框；所述阻
gene expression and metabolic engineering in Bacillus subtilis.Metab Eng.中。
[0023]本专利技术的第三个目的是提供含有所述细胞亚群调控回路的重组枯草芽孢杆菌。
[0024]本专利技术还要求保护所述细胞亚群调控回路或所述重组枯草芽孢杆菌在N-乙酰神经氨酸的生产中的应用。
[0025]有益效果：本专利技术构建了一种细胞亚群调控回路，通过正向响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器调控必需基因表达来偶联生长与合成，从而赋予高产细胞亚群生长优势，提高其在发酵过程中所占的比例，从而得到的一株高产N-乙酰神经氨酸的重组菌株，其产量可达到2.97g/l，是不进行细胞亚群调控的对照菌株的1.55倍。
附图说明
[0026]图1为细胞亚群调控回路结构示意图。
[0027]图2为细胞亚群调控回路生长与合成偶联的效果。
具体实施方式
[0028]重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：
[0029]种子液培养基配方为：10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉；发酵培养基配方为：40g/L葡萄糖，12g/L酵母粉，6g/L胰蛋白胨，6g/L硫酸铵，12g/L三水合磷酸氢二钾，2.5g/L磷酸二氢钾，3g/L硫酸镁，6g/L尿素；
[0030]发酵过程为：挑取单菌落至有1.5ml发酵培养基(含有合适的抗生素，实验组根据需要添加0.1mM的IPTG或者2g/l NeuAc，对照组不添加IPTG)的24孔板中，于37℃、220rpm发酵60小时。
[0031]样品检测方法：首先，将发酵液离心后取上清，加入两倍体积35mM稀硫酸去除胞外蛋白。之后，使用离心机在1400rpm离心10min后，用0.22μm滤膜过滤后，使用液相色谱column(300
×
7.8mm)有机酸柱，检测波长为210nm。流动相采用10mM稀硫酸，流速为0.5mL/min柱温为40摄氏度。
[0032]实施例1细胞亚群调控回路1.1质粒构建
[0033](1)以质粒pHT01-grac2序列(如SEQ ID NO.12)作为模板，以fp-HI2G-8k-f和fp-HI2G-8k-r为引物，PCR扩增获得带有lac I表达框和IPTG诱导型启动子P
grac2
的pHT01载体骨架；
[0034]fp-HI2G-8k-r：GTGTACATTTCACCTCCTTTGGGGTTG；
[0035]fp-HI2G-8k-f：TTCACGTCACGCGTCCATGGAGATCTTTG；
[0036](2)以响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器质粒Bbl-veg105(如SEQ ID NO.13)作为模板，以HI2Vfol-0.4k-2f和HI2Vfol-0.4k-2r为引物，PCR扩增获得有nanR结合位点的启动子P
veg105
片段；
[0037]HI2Vfol-0.4k-1f：AAACGATATACCTTTATACCTGTTATACCATTGTACAACACGAGC；
[0038]HI2Vfol-0.4k-1r：
[0039]CAAAGATCTCCATGGACGCGTGACGTGAAGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCG；
[0040](3)以HI2Vfol-0.4k-2f和HI2Vfol-0.4k-2r为引物，对野生型枯草芽孢杆菌168进行菌落PCR，扩增获得SEQ ID NO.9所示的必需基因folB片段；
[0041]HI2Vfol-0.4k-2f：
[0042]CCTCTGCAGGTTTTTTCTGGCTCCATCATGACTTTTTTCTCGTAATTTCAATTGCTACTGAT；
[0043]HI2Vfol-0.4k-2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
abrB-30bp作为出发菌株。9.含有权利要求1～5任一所述细胞亚群调控回路的重组枯草芽孢杆菌。10.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘延峰，堵国成，曹燕亭，王惠好，卢杨，刘龙，李江华，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：