从脐带血制备PRP的方法及制备PRP在制备糖尿病性难愈合创伤药物中的应用技术

本发明专利技术公开了一种从脐带血制备PRP的方法及制备PRP在制备糖尿病性难愈合创伤药物中的应用，包括如下步骤：使用优选的离心力对脐带血进行第一次离心，去除下层的细胞层，使用优选的离心力将上层的血浆层进行第二次离心，用第二次离心后的上清(乏血小板血浆)调整血小板浓度为(1000

【技术实现步骤摘要】
从脐带血制备PRP的方法及制备PRP在制备糖尿病性难愈合创伤药物中的应用


[0001]本专利技术涉及一种脐带血PRP的制备方法，尤其是利用低离心力获得高回收率脐带血富血小板血浆(PRP)的离心制备方法及PRP在制备糖尿病性难愈合创伤药物中的应用。

技术介绍

[0002]富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP)是将新鲜全血通过特定离心方式得到的含高浓度血小板的血浆，是一种血小板浓缩物，通常为人体正常血小板浓度的3-5倍，含有大量的多种生长因子[Mussano F,Genova T,Munaron L,et al.Platelets. 2016；27(5):467-471]。1984年，Okuda等首先发现从血浆中提取出来的PRP中含有多种生长因子[Umeno Y,Okuda A,Kimura G.Cell Sci.1989；94:567-575]。随着PRP的研究的深入，1997年Whitman等率先将自体PRP制成血小板凝胶与自体骨或异体骨相结合用于口腔颌面外科手术得到了良好的临床疗效[Whitman DH,Berry RL,Green DM.OralMaxillofac Surg.1997；55(11):1294-1299]。2018年，王泽蓉等应用同种异体PRP制成血小板凝胶治疗难愈合性创面患者也取得了良好的效果，愈合率达到86％[王泽蓉,范娅涵,张红等.临床血液学杂志.2018；31(12):895-897]。
[0003]PRP富含多种生物活性蛋白，较为经典的包括多种生长因子和抗菌肽等，用在创伤修复过程中的不同阶段可发挥不同的作用，促进伤口愈合及组织再生，因此已被广泛应用于临床领域，包括整形外科[Wang D,Rodeo SA.JBJS Rev.2017；5(9):e7]、骨科[FotouhiA,Maleki A,Dolati S,et al.Biomed Pharmacother.2018；104:652-660]、心肌再生[Spartalis M,Tzatzaki E,Nikiteas N,et al.Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017；21(18):3983-3984]和运动医学[Kaux JF,Emonds-Alt T.Platelets. 2018；29(3):213-227]等的治疗；加之PRP无论在体内或体外都具有一定的抑菌活性，并已经证明其对黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌等细菌均有抑制作用[Li T,Ma Y,Wang M,et al.Infect Drug Resist.2019；12:297-309]，特别是对慢性难愈性创面的愈合有促进作用[Ahmed M,Reffat SA,Hassan A,et al.Ann VascSurg.2017；38:206-211]，更使得PRP的应用越来越受到了临床的重视和关注。PRP技术已经成为治疗再生医学相关疾病的治疗手段。自体PRP技术已经成为医院临床治疗的收费项目。异基因PRP技术在广州军区总医院已经进行临床试验，得到非常好的治疗效果 [Umeno Y,Okuda A,Kimura G.J Cell Sci.1989；94:567-575]。
[0004]研究发现，脐带血PRP中的血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)和血小板源性生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)这两种生长因子含量高于外周血PRP，而这两种生长因子正是促进组织再生的最重要的生长因子，脐血PRP具有更好的再生医学领域利用价值[Parazzi V,Lazzari L,Rebulla P. 2010；21(7):549-554]。国外相关研究如：2014年，Lorenzo等首次尝试用脐带血PRP治疗胸膜损伤[Rosso L,Parazzi V,Damarco F,et al.Blood Transfus.2014；12Suppl 1:s235-242]；
2015年，Gelmetti等使用脐血血小板治疗表皮松懈症[Parazzi V,LavazzaC,Boldrin V,et al.Cell Transplant.2015；24(12):2573-2584]；2017年，Sindici 等应用脐血血小板治疗放化疗后口腔黏膜炎的治疗，都得到非常好的治疗效果[Piccin A, Rebulla P,Pupella S,et al.Transfusion.2017；57(9):2220-2224]。为此，意大利脐带血应用委员会成立了脐带血血小板胶应用小组，专门开发和应用脐带血的PRP[PaoloRebulla,Simonetta Pupella,Michele Santodirocco,et al.Blood Transfus 2016；14:73-79]。在国内还没有相应的研究。
[0005]PRP的制备通常采用离心法，即通过改变对新鲜全血的离心次数和离心力大小，进而改变富血小板血浆凝胶的体外凝固时间和血块凝缩率，从而获得所需富血小板血浆的一种制备方法。通常手工离心制备富血小板血浆的方法根据盛装容器的不同，可以分为血袋离心法和离心管离心法，但是相比于离心管离心法，血袋离心法会使红细胞和白细胞的清除率大大降低而直接影响PRP的临床应用效果，因此手工离心制备PRP常采用离心管离心法。此外，根据离心次数的不同，又可分为一次离心法、二次离心法和三次离心法。一次离心法操作简单，但血小板回收率不足；三次离心法相比二次离心法而言，操作繁琐，也会导致回收率下降，因此，二次离心法更适合制备PRP。经典的二次离心法包括：
①
AGHALOO法：第1次215g离心10min，第2次863g离心10min；
②
PARAZZI法：第1次550g离心10min,第2次2000g离心15min；
③
PETRUNGARO法：第1次1500g离心6min，第2次1000g离心6min。[Petrungaro PS.Compend Contin Educ Dent.2001； 22(9):729-732,734,736,746；Parazzi V,Lazzari L,Rebulla P.Platelets.2010； 21(7):549-554；康健,袁文.中国组织工程研究.2014；18(3):476-481]。但是，目前采用的二次离心法也存在血小板损伤严重、血小板回收率偏低和浪费资源等问题。血小板的损伤程度会影响制备出的PRP凝胶中VEGF和PDGF等因子的释放而影响PRP的功能，回收率偏低造成资源浪费的同时又限制了PRP产品的开发与应用。因此，需要一种在尽量清除掉血液中的红、白细胞的同时，又能在保持较高回收率的前提下降低血小板损伤的离心管分离脐带血PRP的方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一目的在于提供一种离心管两步离心法制备脐带血PRP的方法，本方法制备的脐带血PRP回收本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从脐带血制备PRP的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，第一次离心：脐带血以450
±
50g离心10min，得到的全血分为下层血细胞层和上层血浆层；步骤2，第二次离心：取上层血浆层以1500
±
50g离心15min，离心后管底的白色沉淀为浓缩血小板，上清为乏血小板血浆；将第二次离心的上清全部吸出至一个新离心管中充分混匀，再将部分上清吸回到白色沉淀的浓缩血小板的离心管内，调整血小板浓度为(1000
±
100)
×
109/L，即得脐带血PRP。2.根据权利要求1所述从脐带血制备PRP的方法，其特征在于，还包括步骤3，将制得的脐带血PRP和剩余的乏血小...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜为，张莉，张亚斌，贺雪萍，杨俊晔，韩俊领，张宇，杨文玲，
申请(专利权)人：协和干细胞基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：