一种软骨细胞外基质仿生可注射水凝胶及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种软骨细胞外基质仿生可注射水凝胶及其制备方法，是通过物理作用和辣根过氧化物酶(HRP)催化交联的脱软骨细胞外基质/对羟基苯丙酸改性壳聚糖/丝素蛋白可注射水凝胶；其制备方法，是将软骨细胞外基质、对羟基苯丙酸改性壳聚糖及丝素蛋白配成溶液后在物理作用以及HRP/过氧化氢催化作用下交联形成的可注射水凝胶；该水凝胶能够在体内充填多样化的软骨缺损，并具有生物活性功能，促进软骨再生。骨再生。

【技术实现步骤摘要】
一种软骨细胞外基质仿生可注射水凝胶及其制备方法


[0001]本专利技术涉及一种可注射水凝胶生物材料，具体说是脱软骨细胞外基质/改性的壳聚糖/丝素蛋白通过物理作用和辣根过氧化物酶(HRP)催化交联形成的可注射水凝胶及其制备方法。属于生物材料及生物医学工程领域。

技术介绍

[0002]软骨损伤是骨科较为常见的疾患。目前对这种软骨损伤的治疗方法包括微骨折、嵌合成形术、自体软骨细胞移植和同种异体骨软骨移植，可减轻疼痛和改善关节功能，然而，这些方法形成软骨缺乏与邻近的宿主组织的良好整合度，且容易形成纤维软骨，因而影响再生软骨的质量而不能达到天然软骨组织的功能性，并可能导致进一步的并发症。因此亟待解决能用于临床的更有效的软骨组织替代物。组织工程技术可以提供替代治疗策略。具有支架材料的组织工程技术包括水凝胶和多孔支架及其与生长因子和/或干细胞复合体系具有植入物可控性、减少供体部位并发症、技术难度较小的程序及术后恢复时间较短等优势，但由于使用生长因子或细胞被食品药品监督管理局作为医疗设备和生物设备，从而产生漫长审批流程。因此，通过采用具有软骨细胞外基质成分和结构仿生的策略构建软骨组织工程支架材料，既可赋予支架生物活性和促进软骨再生，又可缩短报批时间。

技术实现思路

[0003]本专利技术针对生长因子产品审批存在审批困难以及材料与软骨不规则缺损存在整合度差问题，制备通过物理作用和辣根过氧化物酶(HRP)催化交联的脱软骨细胞外基质/壳聚糖/丝素蛋白可注射水凝胶，使其能够在体内充填多样化的软骨缺损，并具有生物活性功能，促进软骨再生。本产品采用天然软骨来源的脱软骨细胞外基质，避免使用生长因子带来的审批问题，更有利于缩短报批时间。
[0004]本专利技术所述软骨细胞外基质/壳聚糖/丝素蛋白可注射水凝胶，是将软骨细胞外基质、对羟基苯丙酸改性壳聚糖及丝素蛋白配成溶液后在物理作用以及HRP/过氧化氢催化作用下交联形成的可注射水凝胶。其具体制备方法包括以下步骤：
[0005]1)改性壳聚糖溶液的配制：配制0.5-1.5％g/mL壳聚糖和0.4％g/mL对羟基苯丙氨酸混合溶液，搅拌6h，加入0.726％g/mL EDC和0.346％g/mL NHS，室温搅拌48h后透析3天，冷冻干燥48h后配制成0.4-2％g/mL对羟基苯丙氨酸改性壳聚糖水溶液；
[0006]2)丝素蛋白溶液配制：称取蚕丝溶于9.3M的溴化锂溶液中配成配制20％g/mL的蚕丝溶液，置于水浴锅中60℃加热4h后，采用3500D透析袋透析48h；随后，更换20％g/mL的PEG溶液继续透析6-10h得到浓缩丝素蛋白溶液；采用10000rpm，4℃，离心20分钟后除去杂质，并通过称重法确定浓缩丝素蛋白浓度，加入适量蒸馏水配制成浓度为1-10％g/mL的溶液；
[0007]3)软骨细胞外基质制备：取新鲜猪来源新鲜软骨片加入浓度为0.01M Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)并采用组织粉碎机粉碎成匀浆状，随后在2000-10000rpm转速下对匀浆液进行差速离心获得沉淀物；将沉淀物收集后将入浓度为1％v/v Triton X-100溶液，并于4℃
下振荡12h，10000rpm离心收集并用蒸馏水重悬反复洗5次，最后一次收集沉淀；继续向沉淀中加入50U/mL Dnase I与1U/mL RNase A，并于37℃下振荡消化12h，10000rpm离心收集并用蒸馏水重悬反复洗5次，最后一次收集沉淀并冷冻于-20℃，冰冻后进行冷冻干燥，获得软骨细胞外基质冻干海绵；
[0008]4)水凝胶的制备：将0.4-2％g/mL改性壳聚糖溶液(含0.3-1.2％v/v的HRP酶溶液且浓度为10mg/mL)和0.2-10％g/mL丝素蛋白溶液(含1-4％v/v过氧化氢溶液且浓度为0.5％g/mL，含1％-3％g/mL软骨细胞外基质)等体积分别装入双管注射器的针筒内，挤压注射器使两种溶液混合形成水凝胶。
[0009]本专利技术与现有技术相比突出优点在于：
[0010]1)材料选取上，生物可降解的天然软骨细胞外基质、丝素蛋白和壳聚糖拥有较好的生物相容性。软骨细胞外基质保留了天然软骨组织的成分，并富含软骨再生的生长因子，可避免因直接使用生长因子而产生漫长审批流程；丝素蛋白具有良好的力学性能，可提高水凝胶力学性能；壳聚糖为线性生物高分子，具有与软骨细胞外基质中糖胺聚糖相似的结构，可补充软骨细胞外基质提取过程中损失的糖胺聚糖成分。
[0011]2)制备工艺上，利用酶交联的方法进行水凝胶制备，具有制备条件温和且无化学物质残留的特点；采用物理混合的方法将软骨细胞外基质添加到水凝胶中可最大限度保持软骨细胞外基质的生物活性。
[0012]3)产物功能上，制备的水凝胶可原位注射，可用于填充不规则软骨空洞，有利于与周围组织进行良好整合；水凝胶在成分和结构上具有与天然软骨细胞外基质相似的组成和三维结构，有利于模拟软骨细胞生存的天然环境，促进软骨组织再生。
具体实施例
[0013]实施例1：
[0014]1)配制1.5％g/mL壳聚糖和0.4％g/mL对羟基苯丙氨酸混合溶液，搅拌6h，加入0.726％g/mL EDC和0.346％g/mL NHS，室温搅拌48h后透析3天，冷冻干燥48h后配制成1％g/mL对羟基苯丙氨酸改性壳聚糖水溶液；
[0015]2)称取5g蚕丝溶于9.3M的溴化锂溶液中配成配制20％g/mL的蚕丝溶液，置于水浴锅中60℃加热4h后，采用3500D透析袋透析48h；随后，更换20％g/mL的PEG溶液继续透析10h得到浓缩丝素蛋白溶液；采用10000rpm，4℃，离心20分钟后除去杂质，并通过称重法确定浓缩丝素蛋白浓度，加入适量蒸馏水配制成浓度为5％g/mL的溶液；
[0016]3)取猪来源新鲜软骨片加入浓度为0.01M Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)并采用组织粉碎机粉碎成匀浆状，随后在2000rpm,6000rpm和10000rpm转速下对匀浆液进行差速离心获得沉淀物；将沉淀物收集后将入浓度为1％v/v Triton X-100溶液，并于4℃下振荡12h，10000rpm离心收集并用蒸馏水重悬反复洗5次，最后一次收集沉淀；继续向沉淀中加入50U/mL Dnase I与1U/mL RNase A，并于37℃下振荡消化12h，10000rpm离心收集并用蒸馏水重悬反复洗5次，最后一次收集沉淀并冷冻于-20℃，冰冻后进行冷冻干燥，获得软骨细胞外基质冻干海绵；
[0017]4)取步骤1)中获得的5mL改性壳聚糖水溶液加入60μL浓度为10mg/mL的HRP酶，混匀后放入双管注射器A管中，然后将0.15g软骨细胞外基质溶于5mL步骤2)中获得的丝素蛋
白溶液并与100μL 0.5％g/mL的过氧化氢溶液一同加入注射器B管中入，将注射器A、B管中溶液挤出，混合后即制备成水凝胶。
[0018]实施例2：
[0019]1)配制1％g/mL壳聚糖和0.4％g/mL对羟基苯丙氨酸混合溶液，搅拌6h，加入0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种软骨细胞外基质仿生可注射水凝胶及其制备方法，是通过物理作用和辣根过氧化物酶(HRP)催化交联的脱软骨细胞外基质/对羟基苯丙酸改性壳聚糖/丝素蛋白可注射水凝胶。2.所述软骨细胞外基质/壳聚糖/丝素蛋白可注射水凝胶，是将软骨细胞外基质、对羟基苯丙酸改性壳聚糖及丝素蛋白配成溶液后在物理作用以及HRP/过氧化氢催化作用下交联形成的可注射水凝胶；其具体制备方法包括以下步骤：1)改性壳聚糖溶液的配制：配制0.5-1.5％g/mL壳聚糖和0.4％g/mL对羟基苯丙氨酸混合溶液，搅拌6h，加入0.726％g/mL EDC和0.346％g/mL NHS，室温搅拌48h后透析3天，冷冻干燥48h后配制成0.4-2％g/mL对羟基苯丙氨酸改性壳聚糖水溶液；2)丝素蛋白溶液配制：称取蚕丝溶于9.3M的溴化锂溶液中配成配制20％g/mL的蚕丝溶液，置于水浴锅中60℃加热4h后，采用3500D透析袋透析48h；随后，更换20％g/mL的PEG溶液继续透析6-10h得到浓缩丝素蛋白溶液；采用10000rpm，4℃，离心20分钟后除去杂质，并通过称重法确定浓缩丝素蛋白浓度，加入适...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淑芳，董云生，齐春晓，徐兰举，齐磊，杜亚东，
申请(专利权)人：河北柯瑞生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：