一种组织工程心肌补片制备方法技术

本发明专利技术公开了一种组织工程心肌补片制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、取成年猪心；S2、冲孔机打孔获取左心室心肌块；S3、心肌块冻存于

【技术实现步骤摘要】
一种组织工程心肌补片制备方法


[0001]本专利技术涉及人胚胎干细胞和诱导型多能干细胞分化为增殖心肌细胞的方法设计
，尤其涉及一种组织工程心肌补片制备方法。

技术介绍

[0002]根据《中国心血管病报告2015》，2014年心血管病死亡率仍居首位，每5例死亡中就有2例死于心血管病。与1990年相比，2013年心血管病死亡的绝对数字增加了46％；其中，缺血性心脏病死亡人数增加了90.9％。冠状动脉堵塞造成的缺血和随后的再灌注会引起不可逆的细胞损伤，造成心肌细胞坏死，心脏收缩功能下降。由于成体心肌细胞缺乏再生能力，无法修复坏死心肌，细胞移植可能成为缺血性心脏病的有效治疗途径。目前，尽管间充质干细胞对心肌梗死病人心功能改善有积极作用，但其在体内分化为心肌细胞的能力有限，长期效果不佳，因此需要更为有效的种子干细胞。胚胎发育过程为干细胞定向分化提供了重要线索，在过去的几年中，通过操控心脏发育关键通路，在心肌定向分化方面取得了重要进展。
[0003]但是，在现有技术中，对心肌补片的制备方法复杂，不能简单高效的满足医疗制备心肌补片的要求需要。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的主要目的在于提供一种简单、稳定高效，能有效促进多能干细胞分化，并制备得到组织工程心肌补片的组织工程心肌补片制备方法。
[0005]为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0006]一种组织工程心肌补片制备方法，包括如下步骤：
[0007]S1、取成年猪心，分离左心室；
[0008]S2、冲孔机打孔获取左心室心肌块；
[0009]S3、心肌块冻存于-80℃至少16小时；
[0010]S4、解冻心肌块，切取厚度为1cm心肌块并用琼脂糖包埋；
[0011]S5、用陶瓷叶片振荡切片机，在1mm振幅、速度0.01～0.03mm/秒、100Hz振动频率条件下，切割心肌块，获得厚度约为300-500μm、直径约为14mm的心肌组织薄片；
[0012]S6、使用SDS和Trixon X-100液体，洗涤和浸泡心肌组织薄片，制备得到去细胞心肌组织薄片；
[0013]S7、将hiPSC-CM体外定向诱导分化14-16日；
[0014]S8、胰蛋白酶消化获取细胞悬液，以2
×
107个细胞/cm2接种量，种植iPSC-CMs于S6制备的去细胞心肌组织薄片，继续培养载hiPSC-CM组织工程心肌薄片1-28日得到组织工程心肌补片。
[0015]在一种优选的实施方式中，对S5得到的心肌组织薄片浸于PBS中，保温4℃过夜。
[0016]在一种优选的实施方式中，所述步骤S6中，制备去细胞心肌组织薄片的步骤为：
[0017]S61、对浸于PBS中，保温4℃过夜的心肌组织薄片用1％SDS洗涤两次，每次1.5小时；
[0018]S62、无菌蒸馏水洗涤15分钟；
[0019]S63、1％Trixon X-100洗涤7分钟；
[0020]S64、PBS洗涤3次，每次15分钟；
[0021]S65、将心肌组织薄片浸于PBS，置于110rpm摇床室温过夜；
[0022]S66、心肌组织薄片在14mm无菌塑料玻片上铺开，薄片外缘固定于玻片边缘得到去细胞心肌组织薄片。
[0023]在一种优选的实施方式中，所述步骤S61、S62、S63和S64均在室温150rpm摇床上进行。
[0024]在一种优选的实施方式中，所述步骤S7中，将hiPSC-CM诱导分化具体步骤为：
[0025]S71、将iPSC以100,000细胞量种植于geltrex包被6孔板；
[0026]S72、每日给予2ml Essential 8培养基；
[0027]S73、第4日细胞铺满板底75-85％传代；细胞传至第4代备用；
[0028]S74、以80,000细胞量种植步骤S73备用的细胞于geltrex包被6孔板单层细胞培养，每日给予2ml Essential 8培养基,于第4日更换培养基为B27-insulin，并添加6μmol CHIR99021；
[0029]S75、激活Wnt途径，诱导分化第3日添加5μmol IWR-1，抑制Wnt途径，第5日更换为2ml B27-insulin培养基，以后隔日换液，诱导分化第8-10日观察到跳动的诱导成功的心肌细胞。
[0030]在一种优选的实施方式中，所述诱导成功的心肌细胞纯度鉴定包括：流式细胞术检测hiPSC-CM纯度；
[0031]具体包括如下步骤：
[0032]步骤一、心肌细胞经过消化后，4％PFA固定；
[0033]步骤二、0.3％Triton打孔，5％BSA封闭；
[0034]步骤三、一抗孵育，PBS漂洗2次；
[0035]步骤四、二抗孵育，PBS漂洗2次；
[0036]步骤五、流式细胞仪检测hiPSC-CM中α-actinin+、cTNT+、MLC2V+及MLC2a+细胞所占比例。
[0037]在一种优选的实施方式中，所述诱导成功的心肌细胞亚型分析包括：检测hiPSC-CM电生理性质和hiPSC-CM亚型分析；
[0038]在一种优选的实施方式中，所述检测hiPSC-CM电生理性质包括如下步骤：
[0039]步骤一、种植hiPSC-CM于35mm细胞培养皿；
[0040]步骤二、加入2ml Tyrode's溶液，给予10μmol电压敏感性染料di-4-ANEPPS染色10分钟；
[0041]步骤三、添加10μmol细胞收缩抑制剂blebbistatin，给予不同频率电刺激及离子通道阻滞或激活剂；
[0042]步骤四、观察hiPSC-CM动作电位变化以及对于药物的反应，100x100像素CMOS摄像机记录光学图像，MATLAB软件处理数据，绘制动作电位波形，计算信号传导速度及动作电位
时程等指标，描绘hiPSC-CM的电生理特点；
[0043]在一种优选的实施方式中，所述hiPSC-CM亚型分析具体包括如下步骤：
[0044]hiPSC-CM经电生理性质检测之后立即用4％PFA固定，免疫荧光法检测cTNI、MLC2V、Kv1.5及HCN4表达，结合电生理学指标，判断各心肌细胞亚型的含量及所占比例。
[0045]在一种优选的实施方式中，所述去细胞心肌组织薄片指标检测包括：去细胞效率检测、细胞外基质检测和静态力学检测；
[0046]在一种优选的实施方式中，所述去细胞效率检测包括如下步骤：
[0047]a.DNA定量分析：
[0048]去细胞心肌薄片经含1％SDS及1％Proteinase K的Tris EDTA溶液消化后，分离DNA，分光光度计法检测残余DNA含量；
[0049]b.细胞免疫荧光：去细胞心肌薄片经DAPI及α-actin染色，检测去细胞残余；
[0050]在一种优选的实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种组织工程心肌补片制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、取成年猪心，分离左心室；S2、冲孔机打孔获取左心室心肌块；S3、心肌块冻存于-80℃至少16小时；S4、解冻心肌块，切取厚度为1cm心肌块并用琼脂糖包埋；S5、用陶瓷叶片振荡切片机，在1mm振幅、速度0.01～0.03mm/秒、100Hz振动频率条件下，切割心肌块，获得厚度约为300-500μm、直径约为14mm的心肌组织薄片；S6、使用SDS和Trixon X-100液体，洗涤和浸泡心肌组织薄片，制备得到去细胞心肌组织薄片；S7、将hiPSC-CM体外定向诱导分化14-16日；S8、胰蛋白酶消化获取细胞悬液，以2
×
107个细胞/cm2接种量，种植iPSC-CMs于S6制备的去细胞心肌组织薄片，继续培养载hiPSC-CM组织工程心肌薄片1-28日得到组织工程心肌补片。2.根据权利要求1所述的组织工程心肌补片制备方法，其特征在于，对S5得到的心肌组织薄片浸于PBS中，保温4℃过夜。3.根据权利要求2所述的组织工程心肌补片制备方法，其特征在于，所述步骤S6中，制备去细胞心肌组织薄片的步骤为：S61、对浸于PBS中，保温4℃过夜的心肌组织薄片用1％SDS洗涤两次，每次1.5小时；S62、无菌蒸馏水洗涤15分钟；S63、1％Trixon X-100洗涤7分钟；S64、PBS洗涤3次，每次15分钟；S65、将心肌组织薄片浸于PBS，置于110rpm摇床室温过夜；S66、心肌组织薄片在14mm无菌塑料玻片上铺开，薄片外缘固定于玻片边缘得到去细胞心肌组织薄片。4.根据权利要求3所述的组织工程心肌补片制备方法，其特征在于，所述步骤S61、S62、S63和S64均在室温150rpm摇床上进行。5.根据权利要求1所述的组织工程心肌补片制备方法，其特征在于，所述步骤S7中，将hiPSC-CM诱导分化具体步骤为：S71、将iPSC以100,000细胞量种植于geltrex包被6孔板；S72、每日给予2ml Essential 8
TM
培养基；S73、第4日细胞铺满板底75-85％传代；细胞传至第4代备用；S74、以80,000细胞量种植步骤S73备用的细胞于geltrex包被6孔板单层细胞培养，每日给予2ml Essential 8
TM
培养基,于第4日更换培养基为B27-insulin，并添加6μmol CHIR99021；S75、激活Wnt途径，诱导分化第3日添加5μmol IWR-1，抑制Wnt途径，第5日更换为2ml B27-insulin培养基，以后隔日换液，诱导分化第8-10日观察到跳动的诱导成功的心肌细胞。6.根据权利要求5所述的组织工程心肌补片制备方法，其特征在于，所述诱导成功的心肌细胞纯度鉴定包括：流式细胞术检测hiPSC-CM纯度；
具体包括如下步骤：步骤一、心肌细胞经过消化后，4％PFA固定；步骤二、0.3％Triton打孔，5％BSA封闭；步骤三、一抗孵育，PBS漂洗2次；步骤四、二抗孵育，PBS漂洗2次；步骤五、流式细胞仪检测hiPSC-CM中α-actinin+、cTNT+、MLC2V+及MLC2a+细胞所占比例。7.根据权利要求5所述的组织工程心肌补片制备方法，其特征在于，所述诱导成功的心肌细胞亚型分析包括：检测hiPSC-CM电生理性质和hiPSC-CM亚型分析；所述检测hiPSC-CM电生理性质包括如下步骤：步骤一、种植hiPSC-CM于35mm细胞培养皿；步骤二、加入2ml Tyrode'...

【专利技术属性】
技术研发人员：王寅，胡行健，蒋蔚蔚，李飞，
申请(专利权)人：王寅，
类型：发明
国别省市：