一种氢氧化铝佐剂吸附百日咳菌毛（Fim）抗原制品的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种氢氧化铝佐剂吸附百日咳菌毛(Fim)抗原的制备方法，所述方法包括如下步骤：首先加入氢氧化铝溶液，再加入一定量的0.85％的氯化钠溶液，在搅拌条件下，加入PB溶液(200mmol/L)，搅拌使充分反应1小时，然后按成品中抗原终浓度为10μg/mL加入Fim原液，充分搅拌后醋酸或氢氧化钠调节步骤(2)中溶液pH值至6.8

【技术实现步骤摘要】
一种氢氧化铝佐剂吸附百日咳菌毛(Fim)抗原制品的制备方法


[0001]本专利技术属于医药生物
，具体的，涉及一种氢氧化铝佐剂吸附百日咳菌毛(Fim)抗原制品的制备方法。

技术介绍

[0002]博得特氏百日咳杆菌(Bordetella pertussis)是引起婴儿呼吸道疾病的一种烈性传染病病原体，世界范围内许多国家因接种百日咳疫苗使该疾病的死亡率和发病率大大降低。近几年，在疫苗接种率达到85％以上的发达国家，出现了因百日咳死亡和发病率升高的现象，尤其是在年龄较大的儿童和青少年中该病例仍在增加，并作为传播者向年龄太小而未接种疫苗的婴儿传播，间接证明了当前主流疫苗的一些不足。百白破疫苗在婴幼儿中长期广泛地应用改变了百日咳疾病的流行模式，即完成免疫程序的婴幼儿可获得免疫保护，由于没有相应的免疫措施致使青少年和成人的免疫保护力迅速衰减。然而这部分人群的感染，导致其成为婴幼儿感染的主要传染源。另外，尽管百日咳抗体能有效地通过母体胎盘传递给胎儿，但由于母体抗体水平过低且婴儿血清抗体迅速下降，使得新生儿得不到足够的保护。目前，呼吁对青少年进行加强免疫及在孕期接种成人百日咳疫苗是最具成本效益的方法。
[0003]目前已上市的百日咳疫苗主要抗原是百日咳毒素(pertussis toxin，PT)和百日咳丝状血凝素(filamentous hemagglutmin，FHA)，部分含有百日咳黏附素(pertactin，PRN)和百日咳菌毛蛋白(fimbriae，Fim)。百日咳菌毛蛋白是一类具有粘附功能的细胞外膜蛋白，有Fim2和Fim3两种血清型。近期两个不同百日咳疫苗的临床试验(来自瑞士和德国的临床试验)，通过ELISA检测抗Fim抗体水平在5-8EU/mL以上显示出与感染百日咳风险的降低呈现一定相关性，因此在无细胞百日咳疫苗中增加Fim抗原具有一定的现实意义。
[0004]为了增强疫苗的免疫效果，通用方法是在疫苗配方中加入铝佐剂。目前已上市的百日咳疫苗都用含铝佐剂(氢氧化铝、磷酸铝)吸附百日咳抗原。经大量研究证实，设计含铝佐剂疫苗需考虑的关键因素在于抗原与铝佐剂的吸附方式和吸附效率。通常认为，静电吸引、疏水吸引和配基交换是铝佐剂吸附抗原的主要吸附方式，其中静电吸引最为常见。因蛋白质易发生折叠，导致构象发生变化，减少了蛋白疏水区域对水环境的暴露，因此限制了由疏水作用而产生的吸附；配基交换是氢氧化铝表面的羟基被抗原表面的磷酸基团所取代，这种吸附方式作用力最强。疫苗的免疫效果与佐剂对抗原的吸附率密切相关，而疫苗中磷酸根和氯化钠浓度等因素会影响着佐剂对抗原的吸附强度。湛琳丽的实验和Gupta等在小鼠中已经证实影响抗原免疫原性的最重要因素之一是佐剂对抗原的吸附率。吸附率越高，免疫效果越好；反之，免疫效果越差。田俊楠等在铝佐剂重组戊型肝炎疫苗中发现，随着疫苗中磷酸根含量的增加，铝佐剂对抗原的最大吸附量逐渐降低，而免疫小鼠后诱导的抗体滴度反而逐渐增高，表明在一定范围内增加磷酸根离子的浓度可降低铝佐剂对抗原的吸附强度，但提高了疫苗诱导的抗体滴度。

技术实现思路

[0005]本发的目的在于提供一种氢氧化铝佐剂吸附百日咳菌毛(Fim)抗原的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0006](1)用注射用水分别配制200mmol/L的磷酸/磷酸盐缓冲液(Phosphere Buffered Saline，PBS)溶液、质量分数为0.85％的氯化钠溶液、5％醋酸和0.1mol/L氢氧化钠溶液，所有溶液经0.22μm滤膜除菌过滤，保存待用；
[0007](2)首先加入氢氧化铝溶液，再加入一定量的0.85％的氯化钠溶液，按成品中Fim抗原终浓度为10μg/mL加入Fim原液，搅拌，室温吸附1小时后，加入200mM/L的PB溶液，充分搅拌，配制完毕后溶液制剂中氢氧化铝的终浓度以Al记为0.4mg/mL、氯化钠的终浓度0.9％、PB的终浓度为2-12mmol/L；或
[0008]首先加入氢氧化铝溶液，再加入一定量的0.85％的氯化钠溶液，在搅拌条件下，加入PB溶液(200mmol/L)，搅拌使充分反应1小时，然后按成品中抗原终浓度为10μg/mL加入Fim原液，充分搅拌，配制完毕后溶液制剂中氢氧化铝的终浓度以Al记为0.4mg/mL、氯化钠的终浓度0.9％、PB的终浓度为2-12mmol/L；
[0009](3)用醋酸或氢氧化钠调节步骤(2)中溶液pH值至6.8-7.0(最优pH值为7.0)，使氢氧化铝与Fim蛋白充分吸附，时间为1小时；
[0010](4)向步骤(3)中溶液补加0.85％的氯化钠溶液至100mL，混匀后制成氢氧化铝-Fim抗原复合物制品，密封4℃保存。
[0011]优选的，步骤(2)中，氢氧化铝溶液中最终铝含量是0.4mg/mL(以Al记)、PB终浓度为2-5mmol/L、pH为6.8-7.0。
[0012]优选的，步骤(2)中，Fim原液来源于百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)提取的Fim抗原原液，更优选的，所述的菌种为CMCC58003。
[0013]本专利技术还涉及所述的方法在制备百日咳疫苗或百白破疫苗中的应用。
[0014]本专利技术的有益效果在于：
[0015]1.发现氢氧化铝对Fim抗原的吸附能力约为2.9mg/mgAl。
[0016]2.在配制氢氧化铝-Fim复合物时增加一定浓度的磷酸盐并适当调解pH值，可提高小鼠血清抗原特异性抗体水平。
附图说明
[0017]图1、不同磷酸盐和pH下的吸附率变化趋势图
[0018]图2、不同复合物免疫动物抗体滴度与复合物中磷浓度的关系
具体实施方式
[0019]原料说明：
[0020]菌种：百日咳博德特氏菌，菌种号为CMCC58003，由武汉生物制品研究所提供；
[0021]PB溶液：浓度是200mmol/L，pH6.5，使用注射用水配制，经0.22μm的除菌滤膜过滤除菌；
[0022]氯化钠溶液：质量分数为0.85％，使用注射用水配制，经0.22μm的除菌滤膜过滤除菌；
[0023]氯化钠溶液：质量分数为0.35％，使用注射用水配制，经0.22μm的除菌滤膜过滤除菌；
[0024]氯化钠溶液：浓度是2mol/L，使用注射用水配制，经0.22μm的除菌滤膜过滤除菌；
[0025]醋酸：质量分数为5％，使用注射用水配制，经0.22μm的除菌滤膜过滤除菌；
[0026]氢氧化钠溶液：浓度是0.1mol/L，使用注射用水配制，经0.22μm的除菌滤膜过滤除菌；
[0027]氢氧化铝溶液：佐剂，购自丹麦Brenntag Biosector公司；
[0028]SPF级CD1小鼠(ICR)，20-24g、雌性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证号:SYXK(鄂)2018-0099，饲养于武汉生物制品研究所实验动物中心。
[0029]实施例1.百日咳菌毛(Fim)抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氢氧化铝佐剂吸附百日咳菌毛(Fim)抗原的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)配置氢氧化铝溶液，并在其中加入0.85％的氯化钠溶液；(2)按成品中Fim抗原终浓度为10μg/mL加入Fim原液，搅拌，室温吸附1小时；(3)加入200mM/L的PB溶液，充分搅拌；配制完毕后溶液制剂中氢氧化铝的终浓度以Al记为0.4mg/mL、氯化钠的终浓度0.9％、PB的终浓度为2-12mmol/L；(4)用醋酸或氢氧化钠调节步骤(3)中溶液pH值至6.8-7.0，使氢氧化铝与Fim蛋白充分吸附，时间为1小时；(5)向步骤(4)中溶液补加0.85％的氯化钠溶液至100mL，混匀后制成氢氧化铝-Fim抗原复合物制品，密封4℃保存。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，氢氧化铝溶液中最终铝含量以Al记是0.4mg/mL、PB终浓度为2-5mmol/L、pH为6.8-7.0。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，Fim原液来源于百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)提取的Fim抗原原液，优选的，所述的菌种为CMCC58003；步骤(4)中调节pH值至7.0。4.一种氢氧化铝佐剂吸附百日咳菌毛(Fim)抗原...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓明，杨柏峰，周以斯，王丽，陈雯，方习静，朱德武，李新国，段凯，
申请(专利权)人：武汉生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：