布鲁氏杆菌的检测试剂盒与检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测布鲁氏杆菌的crRNA、试剂盒及检测方法，其中crRNA选自如下所示的序列：crRNA1：其序列如SEQ ID NO.6所示；crRNA2：其序列如SEQ ID NO.7所示；crRNA3：其序列如SEQ ID NO.8所示；crRNA4：其序列如SEQ ID NO.9所示。本发明专利技术基于布鲁氏杆菌Omp25基因设计并筛选crRNA，同时结合CRISPR

【技术实现步骤摘要】
布鲁氏杆菌的检测试剂盒与检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种布鲁氏杆菌的检测试剂盒与检测方法。

技术介绍

[0002]布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏杆菌(Brucella)感染引起的疾病，是一种人畜共患性全身传染病，简称"布病"，又有地中海弛张热、马耳他热、波浪热等称谓。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定动物报告疾病，我国目前已经在《中华人民共和国传染病防治法》把它归类为乙类传染病，与我们更为熟悉的"非典"、"猪流感"、炭疽、艾滋病、狂犬病、乙肝等同属一类传染病。布鲁菌可通过皮肤黏膜、呼吸道、消化道等途径侵入机体，引起发热、流产、不育、虚弱、关节痛等临床症状。布鲁菌宿主广泛、传染性强，不同种布鲁菌具有宿主间交叉感染的能力，对畜牧业和人类健康均构成严重威胁。因此，在当前严峻的防控形势下研发简便、快速、精确的布鲁氏杆菌检测技术就显得非常迫切。
[0003]布鲁氏杆菌(Brucella)是一种革兰氏阴性的不运动细菌，无荚膜(光滑型有微荚膜)，触酶、氧化酶阳性，绝对嗜氧菌，可还原硝酸盐，细胞内寄生，可以在很多种家畜体内存活。目前，布鲁菌属主要有7个种，为羊种布鲁菌、牛种布鲁菌、猪种布鲁菌、犬种布鲁菌、绵羊附睾种布鲁菌、沙林鼠种布鲁菌和海洋哺乳动物种布鲁菌共21个生物型。布鲁菌广泛分布于世界各地，调查全世界有170个国家和地区有布鲁菌病报道发生，最严重的地区位于地中海沿岸和阿拉伯半岛诸国，该病在印度、墨西哥、美国的南部和中部地区也较普遍。尽管一些国家已经有效控制了布鲁菌病，但中亚地区逐渐成为人布鲁菌病的新发地区。据统计，全球每年出现约50万例人布鲁菌病。布鲁菌病在我国也广泛存在，尤其是在以畜牧业生产为主的地区。2009年全国布鲁菌病监测数据显示，全国有29个省区、市发生畜间布鲁菌病，牛、羊、猪等感染量达百万头之多，见于内蒙、东北、西北等牧区。人布鲁菌病亦呈上升趋势，人布鲁菌病疫情表现出明显的职业性、地区性、季节性，人布鲁菌病可能与接触感染动物有关。因此，必须从根本上预防和控制动物布鲁菌病。
[0004]外膜蛋白与布鲁氏菌的胞内生存有关，涉及侵袭、胞内迁移、复制等很多方面，对维持细胞结构稳定、抵御宿主细胞免疫杀伤有重要作用。外膜蛋白Omp25是布鲁氏菌入侵宿主细胞初期在酸性介质环境中释放的一种蛋白，是布鲁氏菌的重要毒力因子。该蛋白可以引发孕畜流产，缺失Omp25基因的布鲁氏菌致病力下降，且能够保护宿主免受布鲁氏菌的感染。Omp25蛋白具有良好的抗原性，能够诱导小鼠产生免疫反应，使其对布鲁氏菌具有抵抗作用。因此Omp25可以作为布鲁氏菌的特异基因来对其进行分离鉴定。
[0005]病原分离鉴定是诊断布鲁菌病的传统方法，被认为是诊断该病的“金标准”。布鲁菌生长缓慢，所需营养条件复杂，而且样本中必须有活菌存在。而且，布鲁菌分离培养需在p2级以上生物安全实验室进行。另外，细菌学方法不能鉴别与疫苗菌株同生物型的野生菌株分离株，因此，细菌学方法在布鲁菌疫苗株鉴别诊断方面具有局限性。传统的分子检测技术以基因扩增为主，包括核酸杂交技术、常规PCR、巢式PCR、多重PCR等技术。PCR技术敏感、
特异、高效、快速，但假阳性高。核酸杂交技术具有灵敏度高，特异性强，实用性好的特点，是多种动物疫病诊断的常规方法，但操作复杂、成本高，普通实验室没有相应设备，易出现假阳性。基因芯片和高通量测序技术快速简便、特异性强、灵敏度高和高通量化，但成本高和对操作人员水平要求高。这就使得开发布鲁氏菌病的简便、快速、精准的现场诊断方法变得尤为重要。因此，亟需提供一种简单快速，且灵敏度、特异性高的特异性片段检测方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种布鲁氏杆菌的检测试剂盒与检测方法，基于布鲁氏杆菌的Omp25基因设计并筛选相应的crRNA，并结合CRISPR-Cas12系统及RPA等温扩增技术，以检测待测样本中是否存在布鲁氏杆菌，所述试剂盒及检测方法不仅操作简单、检测速度快、成本低，同时检测灵敏度和检测特异性也显著提高。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0008]一种用于检测布鲁氏杆菌的crDNA，所述crDNA选自如下所示的序列：
[0009]crDNA1：其序列如SEQ ID NO.2所示；
[0010]crDNA2：其序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]crDNA3：其序列如SEQ ID NO.4所示；
[0012]crDNA4：其序列如SEQ ID NO.5所示。
[0013]本专利技术还提供了一种用于检测布鲁氏杆菌的crRNA，所述crRNA选自如下所示的序列：
[0014]crRNA1：其序列如SEQ ID NO.6所示；
[0015]crRNA2：其序列如SEQ ID NO.7所示。
[0016]crRNA3：其序列如SEQ ID NO.8所示；
[0017]crRNA4：其序列如SEQ ID NO.9所示。
[0018]本专利技术还提供了一种布鲁氏杆菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述crDNA或crRNA。
[0019]进一步的，所述检测试剂盒还包括Cas12a蛋白和荧光探针。
[0020]进一步的，所述Cas12a蛋白为FnCas12a蛋白。
[0021]进一步的，所述荧光探针序列的5
’
端标记有荧光基团，3
’
端标记有猝灭基团。
[0022]进一步的，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的任一种，所述猝灭基团选自TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的任一种。
[0023]进一步的，所述检测试剂盒中还包括DNA酶抑制剂。
[0024]本专利技术还提供了上述crDNA或crRNA或上述检测试剂盒在检测布鲁氏杆菌的非疾病诊断和治疗目的上的用途。
[0025]本专利技术还提供了一种布鲁氏杆菌的非疾病诊断和治疗目的的检测方法，所述方法包括如下步骤：
[0026]S1、扩增待测样本的核酸得到扩增产物；
[0027]S2、将所述的扩增产物、上述crRNA、Cas12a蛋白、荧光探针和无酶水构成的检测体系进行检测。
[0028]进一步的，将所述检测体系孵育后利用胶体金试纸进行检测或测定荧光值变化。
通过胶体金试纸进行可视化检测时，将孵育后的检测体系加至胶体金试纸的检测区，通过检测线的有无确定检测结果，操作简便快速，使用范围广泛。也可将孵育后的检测体系利用荧光检测仪检测反应前后的荧光变化，进而判断待测样本中是否含有布鲁氏杆菌。
[0029]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0030]本专利技术提供了一种用于检测布鲁氏杆菌的crDNA、crRNA及包含所述crDNA或crRNA的检测试剂盒及检测方法。本专利技术基于布鲁氏杆菌O本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测布鲁氏杆菌的crDNA，其特征在于，所述crDNA选自如下所示的序列：crDNA1：其序列如SEQ ID NO.2所示；crDNA2：其序列如SEQ ID NO.3所示；crDNA3：其序列如SEQ ID NO.4所示；crDNA4：其序列如SEQ ID NO.5所示。2.一种用于检测布鲁氏杆菌的crRNA，其特征在于，所述crRNA选自如下所示的序列：crRNA1：其序列如SEQ ID NO.6所示；crRNA2：其序列如SEQ ID NO.7所示；crRNA3：其序列如SEQ ID NO.8所示；crRNA4：其序列如SEQ ID NO.9所示。3.一种布鲁氏杆菌的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的crDNA或权利要求2所述的crRNA。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括Cas12a蛋白和荧光探针。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述Cas12a蛋白为FnCas12a蛋白。6.根据权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚杰，赵洪友，程诚，
申请(专利权)人：武汉博杰生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：