一种基于重组荧光蛋白探针的致病性弧菌多重快速检测体系和方法技术

本发明专利技术属于生物技术中重组荧光蛋白应用于病原菌检测领域，具体涉及到一种基于重组荧光蛋白探针对副溶血弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌等致病性弧菌的多重快速检测体系和方法。本发明专利技术以重组荧光蛋白为荧光标记物，通过设计特异性的引物和核苷酸探针，建立液相芯片检测体系，实现致病菌的多重快速检测，检测灵敏度到50

【技术实现步骤摘要】
一种基于重组荧光蛋白探针的致病性弧菌多重快速检测体系和方法


[0001]本专利技术属于生物技术中重组荧光蛋白应用于病原菌检测领域，具体涉及到一种基于重组荧光蛋白探针对副溶血弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌等致病性弧菌的多重快速检测体系和方法。

技术介绍

[0002]弧菌是弧菌科弧菌属中的一种菌体短小，形状弯曲呈弧形，长0.8-3μm、宽0.5-1.5μm的革兰氏阴性菌，大多数分布在海水或这入海口附近，寄生在海产品中，对人类的健康造成不小的麻烦。迄今为止发现的弧菌属共有91种，对人类健康造成威胁的有14种，其中以副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌等危害最大。
[0003]副溶血弧菌广泛存在于河口、海洋和沿海环境中。副溶血性弧菌是人类食用处理不当的海产品后发生急性肠胃炎的主要致病因子。藤井于1950年在日本爆发大规模疫情后首先发现副溶血弧菌能够成为食源性疾病的致病因子，该次食源性疾病爆发记录了由副溶血弧菌感染而引发的272例疾病。而在极少数情况下，副溶血弧菌可引起伤口感染、耳部感染或败血症，情况严重的有可能会危及生命。霍乱弧菌是人类霍乱的病原菌，其广泛分布在近海海域、入海口、河流以及虾贝等海产品中，是全世界都十分关注的一种烈性肠道传染病病原菌，其不仅被世界出入境列为检疫A类传染病，其在我国也被列为甲类传染病，可见各国对该菌的重视程度。如果感染霍乱弧菌，轻则机体出现呕吐腹泻，重则出现严重失水而导致死亡。创伤弧菌是海产品和人创口感染的一种弧菌，曾经也被将称为嗜盐性弧菌、海水弧菌等名称，创伤弧菌的形状弯曲，逗点状或者杆状，细菌外有鞭毛存在，所以其运动型比较活泼，具有荚膜，带有荚膜的创伤弧菌具有高毒性。创伤弧菌的感染途径是经过创口进行感染的，创伤弧菌对人们的威胁不在于其能够引起人们腹泻，而是在与其能够引起蜂窝织炎和败血症，人如果被创伤弧菌感染，短时间内只会引起创口出现炎症，引起化脓，但是如果感染的创伤弧菌进入了血液中，就会引败血症，败血症引发之后其致死率达到55％以上。溶藻弧菌广泛分部在海水中，对温度和生活环境中的盐离子浓度要求比较高，是海水中存在的数量最多的弧菌。溶藻弧菌是一种条件致病菌，在温度在25-35℃的环境中容易造成流行性腹泻等症状，也有可能引起中耳炎、败血症等疾病。
[0004]当前，我国采用的食品安全国家标准(GB4789.7-2013)中，关于弧菌的检验，是采用细菌培养和生物化学检验的方法，定性鉴定需要约8-18小时，定量鉴定需要约4-5天。2019年刚刚颁布的我国出入境检验检疫行业标准中，关于水生动物体内副溶血弧菌的检测采取的是实时荧光定量PCR的方法，整个流程可在24小时内完成。上述检测方法不仅耗时长，而且检测通量低，难以满足高通量快速检测的要求。
[0005]建立一种快速、高通量的致病性弧菌检测新方法对致病性的有效防控、保障食品的安全生产和人类的健康极为重要。液相芯片技术是一项独特的集流式技术、荧光微球、激光、数字信号处理和传统化学技术为一体的新型高通量检测技术。该技术以分布于液相体
系中的微球为反应载体，综合了流式细胞检测技术及芯片检测技术二者的优点，其最突出的优势在于仅需少量样本即可同时检测同一样本中多个不同的目的分子，同时具有灵敏度高、操作简便等优点，是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。近年来，随着液相芯片技术的逐渐成熟，已应用于科研和多个分子生物学诊断实验室，显示了较好的应用前景。
[0006]但在Luminex液相芯片检测体系中，需要使用天然的藻红蛋白对抗体或核苷酸分子进行标记，天然藻红蛋白提取步骤多、过程复杂，分离纯化成本高；藻红蛋白还需要与链霉亲和素分子共价交联，才能够用于检测，因此天然的藻红蛋白荧光试剂成本很高；此外，天然藻红蛋白的分子量很大(240kDa)，与生物素化的核苷酸片段结合时会产生空间位阻效应，一定程度上影响了液相芯片的推广应用。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的在于提供一种基于重组荧光蛋白探针对副溶血弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌等致病性弧菌的多重快速检测体系和方法。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用了下述方案：
[0009]一种基于重组荧光蛋白探针致病性弧菌多重快速的检测体系，荧光标记物、引物对和核苷酸探针，所述荧光标记物为通过大肠杆菌表达重组荧光蛋白，将血红素氧化酶Ho1和藻红胆素合成酶pebS组成一个顺反子，插入pRSFDuet-1的第一个表达框中；链霉亲和素Sa和别藻蓝蛋白apcA基因通过Linker连接为融合蛋白SLA，将裂合酶cpcS基因与融合蛋白SLA基因构成顺反子，插入到pRSFDuet-1的第二个表达框中，建构建好的载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过发酵和分离纯化、获得重组荧光蛋白。
[0010]所述副溶血弧菌的毒力基因(TDH)、霍乱弧菌的肠毒素基因(CTX)、创伤弧菌多重毒素基因(RTX)和溶藻弧菌多重毒素基因(HBP)的扩增引物和核苷酸探针分别为：
[0011]其中，副溶血弧菌的毒力基因(TDH)为
[0012]上游引物：TDH-F:ATCTGTCCCTTTTCCTGCC；
[0013]下游引物：TDH-R:BIOTIN-GACCATAAACATCTTCGTAC；
[0014]核苷酸探针：TDH-P:NH2-TTTTTTTTTTTTTTTACCCAAGCTCCGGTCAATG；
[0015]霍乱弧菌的肠毒素基因(CTX)
[0016]上游引物：CTX-F:GGCACGATGATGGATATGTTTCC；
[0017]下游引物：CTX-R:BIOTIN-TCTTGTTCATCTGGATGAGG；
[0018]核苷酸探针：CTX-P:NH2-TTTTTTTTTTTTTTTAACTATATTGTCTGGTCA；
[0019]创伤弧菌多重毒素基因(RTX)
[0020]上游引物：RTX-F:AGAAGGCAATCATACCGCAG；
[0021]下游引物：RTX-R:BIOTIN-TGGCTTAAACAAGGTTTGATC；
[0022]核苷酸探针：RTX-P:NH2-TTTTTTTTTTTTTTTAGGTGGCTATTCACTCAGC；
[0023]溶藻弧菌多重毒素基因(HBP)
[0024]上游引物：HBP-F:CACATCATCCATTCGGGCAA；
[0025]下游引物：HBP-R:BIOTIN-TGAAATACGTACAAGTTCA；
[0026]核苷酸探针：HBP-P:NH2-TTTTTTTTTTTTTCAACCACGGCAACCGCAATGT。
[0027]一种所述检测体系的检测方法，由重组荧光蛋白探针、扩增引物、核苷酸探针组成的检测体系实现致病性弧菌的多重快速检测。
[0028]进一步的说，以待检测样品的DNA模板，利用引物对进行PCR扩增；将引物对应的核苷酸探针与微球偶联得到微球探针，微球探针上述得到的PC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于重组荧光蛋白探针的致病性弧菌多重快速检测体系，荧光标记物、引物对和核苷酸探针，其特征在于：所述荧光标记物为通过大肠杆菌表达的重组荧光蛋白，将血红素氧化酶Ho1和藻红胆素合成酶pebS组成一个顺反子，插入pRSFDuet-1的第一个表达框中；链霉亲和素Sa和别藻蓝蛋白apcA基因通过Linker连接为融合蛋白SLA，将裂合酶cpcS基因与融合蛋白SLA基因构成顺反子，插入到pRSFDuet-1的第二个表达框中，将构建好的载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过发酵和分离纯化，获得重组荧光蛋白。2.按权利要求1所述的基于重组荧光蛋白探针的致病性弧菌多重快速检测体系，其特征在于：所述副溶血弧菌的毒力基因(TDH)、霍乱弧菌的肠毒素基因(CTX)、创伤弧菌多重毒素基因(RTX)和溶藻弧菌多重毒素基因(HBP)的扩增引物和核苷酸探针分别为：副溶血弧菌的毒力基因(TDH)为上游引物：TDH-F:ATCTGTCCCTTTTCCTGCC；下游引物：TDH-R:BIOTIN-GACCATAAACATCTTCGTAC；核苷酸探针：TDH-P:NH2-TTTTTTTTTTTTTTTACCCAAGCTCCGGTCAATG；霍乱弧菌的肠毒素基因(CTX)上游引物：CTX-F:GGCACGATGATGGATATGTTTCC；下游引物：CTX-R:BIOTIN-TCTTGTTCATCTGGATGAGG；核苷酸探针：CTX-P:NH2-TTTTTTTTTTTTTTTAACTATATTGTCTGGTCA；创伤弧菌多重毒素基因(RTX)上游引物：RTX-F:AGAAGGCAATCATACCGCAG；下游引物：RTX-R:BIOTIN-TGGCTTAAACAAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈华新，姜鹏，赵瑾，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：