用于免疫细胞操作的具有稳定的MHC分子的支架制造技术

本发明专利技术涉及人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，以向细胞提供特异性功能性刺激，以获得对于介导肿瘤消退或病毒清除而言理想的表型特性和功能特性。特别地，本发明专利技术的支架包含稳定的MHC I类分子，所述稳定的MHC I类分子包含重链，所述重链包含通过二硫桥连接的α

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于免疫细胞操作的具有稳定的MHC分子的支架


[0001]本专利技术涉及人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，以向细胞提供特异性功能性刺激，以获得对于介导肿瘤消退或病毒清除而言理想的表型特性和功能特性。特别地，本专利技术的支架包含不含抗原肽的稳定的MHC I类分子。支架可以按需负载抗原肽，从而为以肽-MHC定向方式有效扩增和功能刺激特定T细胞提供了灵活的平台。

技术介绍

[0002]在恶性黑色素瘤研究中，免疫治疗方法过继细胞转移(ACT)——其中从患者体内提取来自外周血(PBMC)的肿瘤反应性T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，使其激活并离体扩增，随后返回给患者——在超过50％的患者中表现出临床持久响应。然而，来自PBMC的肿瘤反应性T细胞或TIL的扩增需要大量的离体培养，通常以T细胞分化和功能能力为代价。结果，转移的T细胞产物可能不含有足够频率的、具有适当的表型和功能特征的肿瘤反应性CD8 T细胞，以介导肿瘤消退。此外，大多数此类肿瘤浸润性T细胞可能不是肿瘤特异性的，而是来自外周的旁观者T细胞浸润，其中T细胞受体(TCR)识别不匹配任何肿瘤抗原。最后，由于肿瘤部位存在抑制环境，肿瘤反应性T细胞部分的生长潜力可能降低。
[0003]已经尝试利用人工抗原呈递细胞(aAPC)来克服扩增的T细胞的分化和功能能力不足的问题。aAPC背后的简单概念是它们模拟TCR与由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的特异性抗原肽之间的天然相互作用。这种相互作用是通过能够引发有效免疫响应的T细胞的激活、扩增和分化来产生免疫力的核心步骤。T细胞影响分子(例如细胞因子和共刺激分子)进一步辅助天然T细胞响应的产生，它们诱导T细胞活化和功能。因此，将所有必需的分子掺入单一aAPC支架中是克服T细胞扩增的一些挑战的有希望的工具。aAPC形成了T细胞活化和分化的理想免疫突触。然而，关键的挑战是开发使aAPC能够有效地扩增所提取的TIL同时还保持功能性表型的分子的组合。
[0004]在WO2002072631中公开了利用MHC平台的许多概念，其中一种是MHC构建体，其包含其上连接有一种或多种MHC分子的载体分子。该构建体还可含有生物活性分子，例如共刺激分子或细胞调节分子。预期该MHC构建体特别用于扩增识别该构建体的细胞并用于产生用于治疗疾病(例如癌症等)的治疗组合物。WO2002072631公开了可能适用于T细胞扩增的许多共刺激分子和细胞因子，但没有鉴定出对于T细胞扩增特别合适且有效的任何特定组合。
[0005]US 2011/318380公开了WO2002072631中描述的MHC构建体在癌症疫苗和免疫监测中的应用。然而，US 2011/318380没有举例说明对于T细胞扩增特别合适且有效的共刺激分子和细胞因子的任何特定组合。
[0006]WO2009003492主要关注抗原特异性T细胞的检测，但也公开了抗原特异性T细胞的扩增。其中描述了具有和不具有复合肽的MHC多聚体，其制备方法及其在分析和治疗中使用的方法，包括能够灭活或消除不需要的靶T细胞的抗原特异性T细胞的分离。根据WO2009003492的MHC多聚体可包含葡聚糖支架和共刺激分子和细胞调节分子。然而，该公开
没有明确对于T细胞扩增特别有效的分子的特定组合。
[0007]在WO2009094273中公开了一种用于扩增抗原特异性T细胞的aAPC组合物，其包含纳米颗粒、细胞因子、偶联剂、T细胞受体活化剂和共刺激分子。T细胞受体活化剂可以是与抗原肽结合的MHC分子。此外，描述了扩增的T细胞在过继免疫疗法中的用途。然而，仅探索了aAPC上单一细胞因子(即IL-2)的适合性，并且仅将其与外源细胞因子进行了比较。
[0008]因此，先前对于aAPC支架的公开的共同之处在于它们仅以大致一般性的方式描述该概念。由于只有在组合了刺激分子的特定组合时，才能满足T细胞扩增的成功标准，即活性T细胞的比例高、T细胞的抗原特异性高且T细胞的功能性高，因此非常需要定义明确且有效的aAPC支架。只有当满足T细胞扩增的所有三个成功标准时，才能最佳地制备所得的T细胞群以应用它们的抗肿瘤或抗病毒功能。
[0009]已知的aAPC支架的另一个局限性是其效率低下且生产不灵活，这与加速开发新型免疫疗法的高通量平台的需求不一致。aAPC支架制备的主要瓶颈是由抗原肽呈递对MHC分子的需求造成的。简而言之，MHC分子的再折叠过程很复杂，因为在没有β2-微球蛋白(B2M)和抗原肽的情况下，重链不能折叠成其天然状态。因此，空MHC I类分子极不稳定，容易发生聚集。因此，每一个想要用于T细胞刺激的肽-MHC组合都需要独立的生产线。这造成了困难，因为抗原肽的分布非常广泛，每个患者每个HLA分子有效呈递的估计范围为200.000个肽，而MHC I类分子的种类非常多，现有已知的MHC I类分子超过12.000个。此外，在特定情况下，选择相关的抗原肽取决于目标疾病、患者的MHC特征和可用的T细胞库。因此，目前的一条生产线只能产生一种抗原肽特异性aAPC支架，使得它几乎不可能符合巨大的抗原肽多样性，并且利用传统个性化aAPC生产技术覆盖广泛的可能的抗原肽和MHC分子组合存在挑战。
[0010]重组MHC I类分子在例如细菌中产生，形成不溶性的包涵体。在此之前，将这些包涵体在离液剂(chaotropic agent)溶液中变性，然后在目标特异性抗原肽的存在下去除离液剂(例如通过复性和再折叠)，从而形成pMHC复合物。然后通过凝胶过滤层析从未折叠的蛋白质中纯化pMHC复合物。这是一种费力且效率低下的技术，只能产生一种类型的pMHC。
[0011]已经寻求通过生产带有中间体肽(在MHC分子再折叠后，该中间体肽用目标抗原肽取代)的MHC分子，解决MHC分子的低效率生产问题。这种技术被称为MHC肽交换。然而，交换率并不是100％，可交换肽的损失可能会导致MHC分子的大量损失(高达50％)，而损失的MHC分子无法用于新肽的结合。此外，这种生产方法是耗时的，并且肽交换通常发生在MHC单体阶段，使得该技术不适合用于较大的支架。上述局限性限制了对aAPC支架组装的化学计量学的控制，并提供了与可变产品稳定性相关的挑战，具体取决于所组装的pMHC分子。
[0012]然而，包含pMHC的当前aAPC支架技术的另一个限制是主要组织相容性复合物的固有不稳定性，已知主要组织相容性复合物的寿命依赖于抗原肽。pMHC的不稳定性限制了pMHC保持完全功能从而可用于组装功能性aAPC支架的窗口。同时pMHC复合物的不稳定性也限制了组装好的aAPC复合物可以保持完全功能并且能够有效地且抗原特异性地刺激CD8 T细胞的时间。
[0013]在US 9,494,588中，已经提出提供空MHC I类分子作为从单个生产线生产任意抗原特异性MHC I类分子的便利方法，其中在MHC I类分子折叠之后，可以用抗原肽负载该空MHC I类分子。然而，这种方法是否适合大型aAPC支架的使用纯属推测，且未公开。例如，尚未证明它们能够以与wt MHC分子相似的抗原特异性相本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，其包含聚合物主链，所述聚合物主链上连接有以下模板分子：i.至少一种T细胞影响分子，其选自由以下组成的组：细胞因子、共刺激分子、粘附分子和抗体，和ii.至少一种MHC I类分子，其中所述MHC I类分子包含重链，所述重链包含通过二硫桥连接的α-1结构域和α-2结构域。2.根据权利要求1所述的aAPC支架，其中所述二硫桥在位于α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基与位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基之间形成。3.根据权利要求1或2中任一项所述的aAPC支架，其中所述重链包含选自以下的氨基酸序列：a.SEQ ID NO：1，或b.与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述氨基酸序列包含位于α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基和位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基。4.根据权利要求3所述的aAPC支架，其中位于α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基在氨基酸残基84或85处，并且位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基在氨基酸残基139处。5.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述重链包含选自以下的氨基酸序列：a.SEQ ID NO：2-13中的任一个，或b.与(a)中任一序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。6.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述聚合物主链包含至少5个MHC I类分子，例如至少8个，例如至少10个，例如至少20个，例如至少30个，例如至少40个，例如至少50个，或例如至少100个MHC I类分子。7.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述aAPC支架包含至少两种不同的T细胞影响分子。8.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述T细胞影响分子是细胞因子。9.根据权利要求8所述的aAPC支架，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：IL-21、IL-2、IL-15、IL-1、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-17、IL-22和IL-23。10.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：塞恩，
申请(专利权)人：丹麦技术大学，
类型：发明
国别省市：