本发明专利技术公开了一种热稳定性提升的Escherichia coli酯酶(EstWY酶)突变体，属于酶工程技术领域。本发明专利技术通过对源自Escherichia coli菌株的EstWY酶基因进行突变及密码子优化，获得热稳定性显著提高的突变酶。与野生型半衰期相比，突变体在45℃半衰期大约是野生型的5倍，这表明突变体相比于野生型，同时构建的高效表达的基因工程菌，具有其培养周期短、培养条件简单、目的蛋白产量高、纯化简单的优点。化简单的优点。化简单的优点。
【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性提高的酯酶突变体及其应用
[0001]本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种热稳定性提高的酯酶突变体及其应用。
技术介绍
[0002]酯酶(Esterase)是催化酯类化合物水解的酶系，其作用是水解脂肪族酯和芳香族酯。在水分子的参与下，经过水解作用，将酯类水解为酸类及醇类。反应式如下：R-COOR/(酯)+H2O(水)＝＝＝＝RCOOH(脂酸)+R/OH(醇)。它广泛存在于动物、植物和微生物中。其中，动物胰脏酯酶和微生物酯酶是酯酶的主要来源。由于微生物资源丰富，同时利用微生物发酵产酶具有便于工业化生产等优点，使得酯酶广泛应用于农业、食品酿造、医药化学、污水处理和生物修复等领域，又由于酯酶的酶促反应具有较高的底物专一性、区域选择性/对映选择性，它是合成手性化合物的高效生物催化剂。然而，由于天然酶都是在体内比较温和的环境中发挥作用的，而工业应用过程要求酶在比较严苛的环境(如高温、极端酸碱度、有机溶剂、非天然底物、产物抑制等)中发挥作用，因此天然酶在应用中往往遇到稳定性差等问题。为此必须选择稳定性良好的酶来满足工业生产的要求。通过蛋白质工程手段，提升EstWY酶的热稳定性，是解决这一问题的关键。
[0003]常用的蛋白质工程方法有理性设计(rational design)和非理性设计(irrational design)，分别基于结构功能
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关系和高通量筛选。理性设计存在准确性的缺陷，主要在于蛋白质结构
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功能关系过于庞杂，现今仍缺乏充足的认识。为了有效优化蛋白质的热稳定性，Markus Wyss等人于2001年提出共识理论(Consensus Concept)。和理性设计基于蛋白质精确结构-功能关系不同的是，Consensus Concept理论是基于同源蛋白的氨基酸序列信息，从进化的角度分析能提高酶热稳定性的信息。
[0004]使用原始菌种(如Fervidobacterium nodosum)发酵，存在培养条件苛刻、产酶水平低的问题，获得目标酶较为困难。同时，原始菌种酶系复杂，不能直接使用，而且纯化步骤繁琐，纯化得到的酶也不能直接使用，存在稳定性差的问题。
[0005]自然进化限制了原始EstWY酶的功能，往往不能以最佳的状态应用在工业途径中。使用蛋白质工程的方法，可以对原始基因进行分子改造，打破自然进化的限制，获得适合工业用途，性质优良的新酶基因。所以现阶段EstWY酶的高效表达、纯化及应用端的需求问题一直是本领域技术人员研究的重点和难点。
技术实现思路
[0006]本专利技术以共识理论(Consensus Concept)为指导思想，对酯酶家族序列进行整合分析，并结合生物信息学及晶体学方法辅助，获得具高稳定性的新型酯酶突变体。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术利用共识设计方法获得了热稳定性提高的的EstWY酶突变体、本专利技术采用基于传统的共识方法改进的无系统发育偏见的共识方法筛选得到5个氨基酸突变位点并对其进行定点突变，获得了热稳定显著提升的突变酶，解决了现有的EstWY酶热稳定性差，不能满足应用于试剂的需求的缺陷，为拓宽EstWY酶酶的工业应
用奠定了基础。
[0008]本专利技术第一个目的是提供一种EstWY酶，EstWY酶是来源于Escherichia coli的EstWY酶，命名为ENND-TOP蛋白，编码ENND-TOP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EstWY酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]进一步地，EstWY酶是SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与SEQ ID NO.2所示的蛋白具有相同功能的衍生蛋白。
[0010]进一步地，EstWY酶是通过一个或多个氨基酸残基取代SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中的一个或多个位置上的氨基酸残基而获得的EstWY酶突变体。
[0011]进一步地，EstWY酶是通过一个或多个氨基酸残基取代取代SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中表现出至少90％同源性的氨基酸序列的EstWY酶的氨基酸序列的一个或多个位置上的氨基酸残基而获得的EstWY酶突变体。
[0012]进一步地，SEQ ID NO.2表示的胺脱氢酶氨基酸序列的的突变取代位点包括以下至少一个：第276、279、289、322、358位或它们的相应位置。
[0013]进一步地，EstWY酶突变体包括在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列上S276V，L279F，T289R，R322G，N358D中任一单点突变位点的单点突变体。
[0014]进一步地，EstWY酶突变体包括在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列上的组合突变体：L279F/T289R、L279F/R322G、L279F/N358D、T289R/R322G、T289R/N358D、R322G/N358D、L279F/T289R/R322G、L279F/T289R/N358D、L279F/R322G/N358D、T289R/R322G/N358D、L279F/T289R/R322G/N358D。
[0015]本专利技术第二方面，公开了一种编码EstWY酶突变体的基因。
[0016]本专利技术第三方面，公开了一种含有EstWY酶突变体的基因的重组质粒。
[0017]本专利技术第四方面，公开了一种表达EstWY酶突变体的可溶性蛋白、固定化酶或工程菌。
[0018]进一步地，工程菌为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母和真菌。
[0019]进一步地，工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)工程菌。
[0020]本专利技术第五方面，公开了一种EstWY酶突变体的构建方法，包括以下步骤：
[0021]A1、通过在Pfam数据库及NCBI数据库中搜索ENND-TOP氨基酸序列，去除重复出现的相同序列后选取与目标蛋白序列一致性大于40％的蛋白质序列，然后通过Clustalx1.83软件进行多序列比对，生成fasta.文件，将fasta.文件上传到Consensus Maker v2.0.0服务器，修改设置参数，通过Clustalx1.83软件生成可以后期编辑的共识序列，将目的蛋白ENND-TOP的氨基酸序列与该家族共识序列以及各位点氨基酸丰度图进行对照比较；
[0022]A2、通过在线软件Swiss-model获得了ENND-TOP的结构模型；
[0023]A3、用PyMOL观测晶体结构，根据结构信息复查待选突变位点及突变形式，设置筛条件，筛选出ENND-TOP热稳定性的突变体；
[0024]A4、根据ENND-TOP结构模型，分析A3中获得的突变体，根据判断准则筛选出提高ENND-TOP蛋白热稳定性的突变体S276V，L279F，T289R，R322G，N358D；
[0025]进一步地，步骤A4中判断准则为：
①
突变应消除原有的不利于热稳定的作用力形式，如静电排斥作用、电本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种EstWY酶，其特征在于，所述EstWY酶是来源于Escherichia coli的EstWY酶，命名为ENND-TOP蛋白，编码ENND-TOP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述EstWY酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.如权利要求1所述的EstWY酶，其特征在于，所述EstWY酶是SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与SEQ ID NO.2所示的蛋白具有相同功能的衍生蛋白。3.如权利要求1所述的EstWY酶，其特征在于，所述EstWY酶是通过一个或多个氨基酸残基取代SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中的一个或多个位置上的氨基酸残基而获得的EstWY酶突变体。4.如权利要求1所述的EstWY酶，其特征在于，所述EstWY酶是通过一个或多个氨基酸残基取代SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中表现出至少90％同源性的氨基酸序列的EstWY酶的氨基酸序列的一个或多个位置上的氨基酸残基而获得的EstWY酶突变体。5.一种编码如权利要求3或4所述的EstWY酶突变体的基因。6.一种包含如权利要求4所述的基因的重组质粒。7.一种包含如权利要求1-4任一所述的EstWY酶突变体的可溶性蛋白、固定化酶或工程菌。8.一种如权利要求1-4任一所述的EstWY酶突变体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A1、通过在Pfam数据库及NCBI数据库中搜索ENND-TOP氨基酸序列，去除重复出现的相同序列后选取与目标蛋白序列一致性大于40％的蛋白质序列，然后通过Clustalx1.83软件进行多序列比对，生成fasta.文件，将fasta.文件上传到Consensus Maker v2.0.0服务器，修改设置参...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨广宇，马富强，秦朕龙，郭天杰，李长龙，
申请(专利权)人：上海绅道生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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