【技术实现步骤摘要】
一种重组切刻限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法
[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种重组切刻限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法。
技术介绍
[0002]限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶，根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型(TypeI)、第二型(TypeII)及第三型(TypeIII)，Ⅱ型限制与修饰系统所占的比例最大达93％。
[0003]第一型限制酶同时具有修饰及识别切割的作用；另有识别DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位距离识别位可达数千个碱基之远，例如：EcoB、EcoK。
[0004]第三型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及识别切割的作用，可识别短的不对称序列，切割位与识别序列约距24-26个碱基对，例如：HinfⅢ。
[0005]第二型限制酶只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行，所识别的位置多为短的回文序列；所剪切的碱基序列通...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种重组切刻限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤S1：表达质粒pACYCDuet-GST-NT.BstNBI的构建；步骤S2：保护质粒pBAD-M.NT.BstNBI的构建；步骤S3：NT.BstNBI的表达、纯化与鉴定。2.根据权利要求1所述的一种重组切刻限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于：步骤S1的具体步骤如下：步骤S11：NT.BstNBI的基因合成：根据密码子优化后的基因序列，直接进行基因合成，制得NT.BstNBI基因；步骤S12：GST标签的基因合成：根据密码子优化后的基因序列，直接进行基因合成，制得GST标签；步骤S13：Gibson重组连接：将pACYCDuet-1通过PCR进行线性化，将线性化产物与步骤S11制得的产物NT.BstNBI基因进行无缝克隆，制得重组连接产物；步骤S14：重组连接产物转化：将步骤S13制得的重组连接产物取20μL加入DH5α感受态细胞中，在冰上混合均匀后静置15min，在温度为42℃的条件下，进行热激120s后，再在冰上静置5min后，加入LB液体培养基A500μL，在温度为37℃，摇床转速200r/min的条件下，进行摇床培养45min后，涂布于LB固体培养基A平板中，在温度为37℃的条件下，进行过夜培养，制得重组克隆；步骤S15：重组克隆的鉴定：随机挑取3个步骤S14制得的重组克隆，接入LB液体培养基B中，在温度为37℃，摇床转速200r/min的条件下，进行过夜培养，抽提质粒并测序，制得表达质粒pACYCDuet-GST-NT.BstNBI。3.根据权利要求2所述的一种重组切刻限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于：步骤S14所述的LB液体培养基A由如下步骤制成：将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、蒸馏水900mL进行混合，至胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠完全溶解后，调节溶液pH值为7.0并定容至1L，制得LB液体培养基。4.根据权利要求2所述的一种重组切刻限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于：步骤S14所述的LB固体培养基A由如下步骤制成：将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、氯霉素、蒸馏水900mL进行混合后，加入15g琼脂粉并定容至1L，所述的氯霉素的用量为50μg/mL。5.根据权利要求2所述的一种重组切刻限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于：步骤S14所述的LB液体培养基B与LB液体培养基A相比加入了氯霉素，氯霉素的用量为50μg/mL。6.根据权利要求1所述的一种重组切刻限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于：步骤S2的具体步骤如下：步骤S21：M.NT.BstNBI的基因合成：根据密码子优化后的基因序列，直接进行基因合成，制得M.NT.BstNBI基因；步骤S22：Gibson重组连接：将pBAD-HisA通过PCR进行线性化，将线性化产物与步骤S21制得的产物M.NT.BstNBI基
因以及步骤S12制得的GST标签进行无缝克隆，制得重组连接产物；步骤S23：重组连接产物转化将步骤S22制得的重组连接产物取20μL加入DH5α感受态细胞中，在冰上混合均匀后静置15min，在温度为42℃的条件下，进行热激120s后，再在冰上静置5min后，加入LB液体培养基A500μL，在温度为37℃，摇床转速200r/min的条件下，进行摇床培养45min后，涂...
【专利技术属性】
技术研发人员：雍金贵，雍德祥，李森，张伦，
申请(专利权)人：安徽环球基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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