一种针对人源化免疫系统小鼠的基因编辑方法及其用途技术方案

本发明专利技术涉及一种人源化NPLG IL3 GM

【技术实现步骤摘要】
一种针对人源化免疫系统小鼠的基因编辑方法及其用途


[0001]本专利技术涉及动物基因工程和基因遗传修饰
，具体为针对人源化免疫系统小鼠的基因编辑方法及其用途。

技术介绍

[0002]在生物医药实验中，为了更好地研究和治疗人类疾病，往往需要利用多种不同种属的动物，如大小鼠等等，来模拟人类疾病，在其中进行相关研究。但是啮齿类动物和人往往有较大的种属差异，基于大小鼠的动物模型所取得的实验结果往往和人群中的结果有较大的差距，并不能如实反映人体中药物的作用情况。而灵长类动物的应用则受到成本，动物福利和伦理学等的诸多限制。在此情况下，为了更好的研究人类血和免疫系统的功能，人源化免疫系统小鼠应运而生。申请人此前研发了用于制作人源化免疫系统小鼠所用的重度免疫缺陷的转基因NPLG小鼠(CN202010373356.5)，及具有髓系细胞的人源化免疫系统小鼠(CN202010290960.1)，较好的满足了新药评价需求。
[0003]此前的免疫系统人源化小鼠，包括第一代人源化免疫系统小鼠，及具有髓系免疫细胞的人源化小鼠，均有各自的缺点。其中第一代人源化免疫系统小鼠，由于其体内的鼠源髓系免疫细胞功能基本完整，且促进髓系免疫细胞发育的细胞因子在人和小鼠之间基本没有同源性，故其体内移植的人源干细胞只能发育成为T，B淋巴细胞，而基本不能发育成髓系免疫细胞。故第一代人源化免疫系统小鼠体内的人源髓系免疫系统是基本缺失的，无法用于针对髓系免疫细胞相关靶点的药物筛选。而目前的具有髓系免疫细胞的人源化免疫系统小鼠，基本均是基于在极重度免疫缺陷小鼠体内，通过转基因技术，过表达促进人髓系免疫细胞发育的细胞因子，包括GM-CSF (CSF2), IL3, G-CSF或M-CSF等。通过表达这些细胞因子，可以促进小鼠体内移植的人源造血干细胞发育为髓系免疫细胞。但是，普通的转基因手段转入的人源细胞因子表达的相关基因，均使用功能较强的启动子和增强子，且不可再次调控。故相关细胞因子在小鼠体内的表达量远高于正常的生理水平，可达正常人体水平的1000倍以上。在高剂量的GM-CSF和IL3等细胞因子的作用下，人源髓系免疫细胞会过度发育，得到高于正常水平的髓系免疫细胞，包括巨噬细胞，粒细胞和DC细胞等等。而髓系细胞的发育过程和淋巴细胞不同，不会因其在小鼠体内发育就与小鼠的组织相兼容。过高的髓系免疫细胞会造成小鼠贫血，并产生针对小鼠的移植物抗宿主反应，即髓系GVHD。导致其寿命相比第一代人源化免疫系统小鼠缩短，从超过一年缩减到半年左右，可能影响药物的给药周期，从而限制了该动物的使用。

技术实现思路

[0004]为了解决上述现有技术存在的问题，本专利技术设计并制作了新一代具有髓系免疫细胞的人源化小鼠。这种小鼠将此前常见的人源细胞因子转基因过表达技术，改为直接对小鼠的髓系免疫细胞发育的细胞因子基因进行人源基因的原位替换。该技术可以解决此前的人源免疫细胞小鼠中常见的具有过高水平的人源细胞因子及髓系免疫细胞的问题，可以在
保证拥有人源髓系免疫功能的同时，有效延长小鼠的寿命。同时，由于小鼠的相关细胞因子基因被替换，使小鼠的髓系免疫系统发育受到了进一步抑制。这在一定程度上解除了小鼠髓系免疫细胞，对移植的人源造血干细胞及其发育得来的人源免疫细胞的攻击和抑制。从而使其可以更好的定植在小鼠体内，并提高人源细胞移植的成功率和重建比例。总之，在此技术上发展得来的人源化免疫系统小鼠，拥有更高的人源细胞重建比例及成功率，更长的寿命，可以更好的发挥其应用价值。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠的制备方法，所述方法包括对重度免疫缺陷小鼠NPLG小鼠的IL3，GM-CSF（CSF2）和Kitlg基因进行人源基因的原位敲入替换。
[0006]进一步的，具体包括如下步骤：1）制备人源化IL3 GM-CSF小鼠；并通过PCR扩增鉴定筛选人源化IL3 GM-CSF纯合小鼠；2）制备人源化Kitlg小鼠；并通过PCR扩增鉴定筛选人源化Kitlg 纯合小鼠；3）将步骤1）获得的人源化IL3 GM-CSF纯合小鼠与步骤2）获得的人源化Kitlg纯合小鼠杂交，得到人源化IL3 GM-CSF Kitlg杂合小鼠。
[0007]进一步的，所述步骤3），还包括将人源化IL3 GM-CSF Kitlg杂合小鼠通过多次同胞交配，并进行PCR鉴定，获得IL3 GM-CSF Kitlg纯合小鼠。
[0008]进一步的，所述人源化IL3 GM-CSF小鼠是将NPLG小鼠IL3基因的p.A27信号肽至GM-CSF基因的TGA终止密码子区段整体替换为如下区段： 人类IL3基因的p.A20信号肽至TGA终止密码子序列 + 小鼠IL3基因的UTR非翻译区序列 + 小鼠IL3基因5号外显子下游500bp的序列 + 小鼠CSF2基因ATG起始密码子上游5kbp的序列 + 小鼠CSF2基因的p.M1到p.S17信号肽序列 + 人类CSF2基因的p.A18信号肽到TGA终止密码子序列。小鼠IL3的信号肽p.M1-p.Q26及小鼠CSF2的信号肽p.M1-p.S17将保留在该敲入策略中。
[0009]进一步的，所述人源化Kitlg小鼠是将NPLG小鼠Kitlg基因2号外显子的部分蛋白编码区(CDS区)替换为人Kitlg基因的CDS区(p.E26-p.V273 + 3
×
SV40 polyA)。小鼠的信号肽(p.M1-p.T25)将保留在该敲入策略中。
[0010]优选的，所述步骤1）制备人源化IL3 GM-CSF小鼠包括构建供体载体，其含有核苷酸序列SEQ No.1；将Cas9，gRNA和供体载体共同显微注射到小鼠受精卵中，以产生拥有目标敲入基因片段的小鼠；进一步优选的，所述gRNA选自：gRNA-A1 (与正向序列互补): GGACTCCAAGCTTCAATCAG-TGG（SEQ No .3）；gRNA-A2 (与反向序列互补): GGCCTGGGCTTCCTCATTTT-TGG（SEQ No .4）；和gRNA-B1 (与正向序列互补): CCCGGCCACTGATTGAAGCT-TGG（SEQ No .5）；gRNA-B2 (与反向序列互补): GGGCTTCCTCATTTTTGGAC-TGG（SEQ No .6）。
[0011]优选的，所述步骤2）制备人源化Kitlg小鼠包括构建供体载体，其含有核苷酸序列SEQ No.2；将Cas9, gRNA和供体载体共同显微注射到小鼠受精卵中，以产生拥有目标敲入基因片段的小鼠；进一步优选的，所述gRNA选自：gRNA-C1 (与正向序列互补): ATCTCCTTGGTTTTGACGAG-AGG（SEQ No .10）；gRNA-C2 (与反向序列互补): TCAAAACCAAGGAGATCTGC-GGG（SEQ No .11）。
[0012]进一步的，所述步骤1）PCR扩增鉴定筛选采用如下引物：
同源臂引物Primer F: GCTCCTGATGCTCTTCCA（本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠的制备方法，所述方法包括对重度免疫缺陷小鼠NPLG小鼠的IL3，GM-CSF（CSF2）和Kitlg基因进行人源基因的原位敲入替换；其特征在于包括如下步骤：1）制备人源化IL3 GM-CSF小鼠；并通过PCR扩增鉴定筛选人源化IL3 GM-CSF纯合小鼠；2）制备人源化Kitlg小鼠；并通过PCR扩增鉴定筛选人源化Kitlg 纯合小鼠；3）将步骤1）获得的人源化IL3 GM-CSF纯合小鼠与步骤2）获得的人源化Kitlg纯合小鼠杂交，得到人源化IL3 GM-CSF Kitlg杂合小鼠；所述人源化IL3 GM-CSF小鼠是将NPLG小鼠IL3基因的p.A27信号肽至GM-CSF基因的TGA终止密码子区段：SEQ No.16整体替换为如下区段： 人类IL3基因的p.A20信号肽至TGA终止密码子序列：SEQ No.17+ 小鼠IL3基因的UTR非翻译区序列：SEQ No.18 + 小鼠IL3基因5号外显子下游500bp的序列：SEQ No.19 + 小鼠CSF2基因ATG起始密码子上游5kbp的序列：SEQ No.21+ 小鼠CSF2基因的p.M1到p.S17信号肽序列：SEQ No.22+ 人类CSF2基因的p.A18信号肽到TGA终止密码子序列：SEQ No .23；所述人源化Kitlg小鼠是将NPLG小鼠Kitlg基因2号外显子的部分蛋白编码区(CDS区)替换为人Kitlg基因的CDS区，即p.E26-p.V273序列： SEQ No.24 + 3
×
SV40 polyA序列：SEQ No.25。2.根据权利要求1所述的一种人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠的制备方法，其特征在于所述步骤3）还包括将人源化IL3 GM-CSF Kitlg杂合小鼠通过多次同胞交配，并进行PCR鉴定，获得IL3 GM-CSF Kitlg纯合小鼠。3.根据权利要求1或2任一项所述的一种人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠的制备方法，其特征在于所述步骤1）制备人源化IL3 GM-CSF小鼠包括构建供体载体，其含有核苷酸序列SEQ No.1；将Cas9，gRNA和供体载体共同显微注射到小鼠受精卵中，以产生拥有目标敲入基因片段的小鼠。4.根据权利要求3所述的一种人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠的制备方法，其特征在于步骤1）涉及的gRNA选自：gRNA-A1 (与正向序列互补):SEQ No .3；gRNA-A2 (与反向序列互补):SEQ No .4；或gRNA-B1 (与正向序列互补): SEQ No .5；gRNA-B2 (与反向序列互补):SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨楠，仝莉，黄哲夫，陈洁，罗艳，段继峰，
申请(专利权)人：澎立生物医药技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：