用于表达Agrin蛋白的重组质粒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及用于表达Agrin蛋白的重组质粒及其构建方法和应用。本发明专利技术通过重叠延伸RT

【技术实现步骤摘要】
用于表达Agrin蛋白的重组质粒及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及用于表达Agrin蛋白的重组质粒及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]聚集蛋白(Agrin)是神经元衍生的肝素-硫酸盐蛋白聚糖，为运动神经末梢合成和释放的细胞外基质蛋白，同时也是LRP4和MuSK相互作用的调节者，二者通过其产生结合力，人源基因定位于染色体1p36.33，Agrin蛋白分子量为217kDa，存在6个转录本和5种蛋白质变体。Agrin蛋白含有9个卵泡抑素样结构域，4个表皮细胞生长因子(EGF)样结构域，中心含有1个层粘连蛋白β样结构域和3个层粘连蛋白G(LG)样结构域，还含有1个富含丝苏氨酸的结构域。Agrin基因通过不同的剪切模式，分为神经型Agrin(N-Agrin)和肌肉型Agrin(M-Agrin)这两种具有组织表达特异性的不同亚型。具有4个AA插入片段的同工型(y+)和具有8个AA插入片段的(z+8)同工型都是神经元特异性的Agrin基因。
[0003]重症肌无力(Myasthenia gravis，MG)是一种由自身抗体介导的神经-肌肉接头传递功能障碍的获得性自身免疫性疾病，表现为肌无力和易疲劳。从运动神经元末梢释放的N-Agrin与跨膜蛋白低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4)结合，激活肌肉特异性受体酪氨酸激酶(MuSK)使其磷酸化，诱导烟碱型乙酰胆碱受体(n-AChR)在肌细胞膜上聚集表达，对调节神经肌肉接头(NMJ)的形成、维持及再生具有重要作用。少数MG病人Agrin抗体的存在可导致神经肌肉传递障碍。作为一种致病性抗体，Agrin抗体阳性的MG患者临床特征及治疗预后还不明确，Agrin抗体的检测将大幅提高MG实验诊断的灵敏度和特异性，对MG的诊断、治疗以及预后具有重要指导意义。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供了用于表达Agrin蛋白的重组质粒及其构建方法和应用，目的是为了解决现有技术中无法准确获取神经型Agrin，以及还没有可以在真核细胞中表达Agrin蛋白的质粒，因此无法高灵敏度和强特异性与Agrin抗体结合，从而无法有效应用于实验诊断中的技术问题。
[0005]本专利技术提供的用于表达Agrin蛋白的重组质粒，具体技术方案如下：
[0006]用于表达Agrin蛋白的重组质粒，包括载体质粒，所述载体质粒上重组连接有Agrin蛋白编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述载体质粒为真核表达质粒，所述载体质粒还携带有荧光报告基因。
[0007]在某些实施方式中，所述荧光报告基因为GFP标签蛋白基因。
[0008]本专利技术还提供了上述用于表达Agrin蛋白的重组质粒的构建方法，包括如下步骤：
[0009]S1，抽提人组织中的总RNA经过逆转录，获得cDNA；按照SEQ ID NO.1所示的序列，加入酶切位点，设计引物1和引物2；按照序列SEQ ID NO.1的5658位点设计正反向重叠的引物3和引物4；以所述cDNA为模板，利用引物1、引物2、引物3和引物4进行重叠延伸RT-PCR，获
得重叠延伸RT-PCR产物；
[0010]S2，对步骤S1中的重叠延伸RT-PCR产物和真核表达质粒分别依据步骤S1中的酶切位点进行双酶切，获得Agrin目的基因片段和真核表达质粒片段；
[0011]S3，将步骤S2中的Agrin目的基因片段与真核表达质粒片段使用T4连接酶进行连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行扩大培养，抽提质粒，即为用于表达Agrin蛋白的重组质粒。
[0012]在某些实施方式中，步骤S1中，所述引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，所述引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述引物3的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，所述引物4的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，所述酶切位点为SgfⅠ和MluⅠ。
[0013]在某些实施方式中，步骤S1中，以所述cDNA为模板，利用引物1和引物4进行PCR扩增SEQ ID NO.1所示序列上游的5658bp的基因片段，获得第一次PCR产物；
[0014]以所述cDNA为模板，利用引物2和引物3进行PCR扩增SEQ ID NO.1所示序列下游的546bp的基因片段，获得第二次PCR产物；
[0015]以所述第一次PCR产物和所述第二次PCR产物以摩尔比1：1混合作为模板，利用引物1和引物2进行PCR扩增，获得所述重叠延伸RT-PCR产物。
[0016]在某些实施方式中，步骤S2中，所述真核表达质粒为pCMV-AC-GFP质粒，使用限制性内切酶SgfⅠ和MluⅠ进行双酶切。
[0017]在某些实施方式中，步骤S3中，所述Agrin目的基因片段与所述真核表达质粒片段摩尔比为(3-10):1。
[0018]本专利技术还提供了上述用于表达Agrin蛋白的重组质粒的应用，利用上述用于表达Agrin蛋白的重组质粒检测血清中的Agrin抗体。
[0019]在某些实施方式中，包括如下步骤：
[0020]1)将用于表达Agrin蛋白的重组质粒转染培养好的HEK293T细胞，继续培养48-60h后，获得表达Agrin蛋白的HEK293T细胞；
[0021]2)将步骤1)中的表达Agrin蛋白的HEK293T细胞依次进行细胞固定和封闭、通透，获得处理后的表达Agrin蛋白的HEK293T细胞；
[0022]3)将待测血清加入步骤2)中的处理后的表达Agrin蛋白的HEK293T细胞进行第一次孵育，加入荧光二抗进行第二次孵育，然后采用荧光显微镜进行观察，检测出血清中的Agrin抗体。
[0023]在某些实施方式中，步骤1)中，所述用于表达Agrin蛋白的重组质粒为pCMV6-AC-Agrin-GFP质粒；将所述HEK293T细胞以(2.0-3.0)
×
104每孔的数量铺于24孔板，当细胞汇合70-80％时，进行转染；
[0024]步骤2)中，所述细胞固定是采用4％多聚甲醛在4℃下固定15-30min；所述封闭、通透为利用含有5％牛血清白蛋白和0.5％TritonX-100的PBS溶液在室温下封闭、通透3h，或者在4℃下过夜封闭、通透；
[0025]步骤3)中，所述第一次孵育的温度为室温，所述第一次孵育的时间为45-60min，所述荧光二抗为Alexa Fluor
TM 568标记的羊抗人IgG，所述第二次孵育的温度为室温，所述第二次孵育的时间为1-2h。
[0026]在某些实施方式中，步骤3)中，所述荧光显微镜的激发光为蓝色激发光和绿色激
发光。
[0027]本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过重叠延伸RT-PCR获得Agrin全长基因片段，重组至真核表达质粒上，从而可以高效地在真核细胞中表达Agrin蛋白，并且以上述表达的Agrin蛋白作为抗原与血清中的Agrin抗体进行高效结合，所使用试剂均为常本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于表达Agrin蛋白的重组质粒，其特征在于，包括载体质粒，所述载体质粒上重组连接有Agrin蛋白编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述载体质粒为真核表达质粒，所述载体质粒还携带有荧光报告基因。2.根据权利要求1所述的用于表达Agrin蛋白的重组质粒，其特征在于，所述荧光报告基因为GFP标签蛋白基因。3.用于表达Agrin蛋白的重组质粒的构建方法，用于构建权利要求1或2中所述的用于表达Agrin蛋白的重组质粒，其特征在于，包括如下步骤：S1，抽提人组织中的总RNA经过逆转录，获得cDNA；按照SEQ ID NO.1所示的序列，加入酶切位点，设计引物1和引物2；按照序列SEQ ID NO.1的5658位点设计正反向重叠的引物3和引物4；以所述cDNA为模板，利用引物1、引物2、引物3和引物4进行重叠延伸RT-PCR，获得重叠延伸RT-PCR产物；S2，对步骤S1中的重叠延伸RT-PCR产物和真核表达质粒分别依据步骤S1中的酶切位点进行双酶切，获得Agrin目的基因片段和真核表达质粒片段；S3，将步骤S2中的Agrin目的基因片段与真核表达质粒片段使用T4连接酶进行连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行扩大培养，抽提质粒，即为用于表达Agrin蛋白的重组质粒。4.根据权利要求3所述的用于表达Agrin蛋白的重组质粒的构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，所述引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述引物3的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，所述引物4的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，所述酶切位点为SgfⅠ和MluⅠ；以所述cDNA为模板，利用引物1和引物4进行PCR扩增SEQ ID NO.1所示序列上游的5658bp的基因片段，获得第一次PCR产物；以所述cDNA为模板，利用引物2和引物3进行PCR扩增SEQ ID NO.1所示序列下游的546bp的基因片段，获得第二次PCR产物；以所述第一次PCR产物和所述第二次PCR产物以摩尔比1：1混合作为模板，利用引物1和引物2进行PCR扩增，获得所述重叠延伸RT-PCR产物。5.根据权利要求3所述的用于表达Agrin蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：高峰，王淑敏，张迎娜，杨浩楠，吕杰，张婧，赵雪，王璐璐，方华，
申请(专利权)人：河南省医药科学研究院，
类型：发明
国别省市：