高纯度甜菊糖苷制造技术

描述了制备高度纯化的甜菊糖苷的方法，特别是甜菊单糖苷，甜菊单糖苷A，甜菊双糖苷，甜菊双糖苷A，甜菊双糖苷B，甜茶苷，甜菊苷，甜菊苷A(瑞鲍迪苷KA)，甜菊苷B，甜菊苷C，瑞鲍迪苷E，瑞鲍迪苷E2，瑞鲍迪苷E3和/或瑞鲍迪苷AM。该方法包括使用酶制剂和重组微生物将不同的起始组合物转化为目标甜菊糖苷。高度纯化的瑞鲍迪苷用作可食用和可咀嚼组合物例如任意饮料，糖食，焙烤食品，饼干和口香糖中的无热量甜味剂，风味增强剂，甜味增强剂和泡沫抑制剂。甜味增强剂和泡沫抑制剂。甜味增强剂和泡沫抑制剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高纯度甜菊糖苷


[0001]本专利技术涉及用于制备包含甜菊糖苷的组合物(包括高度纯化的甜菊糖苷组合物)的方法。
[0002]专利技术背景
[0003]高强度甜味剂具有大于蔗糖甜味水平许多倍的甜味水平。它们主要为无热量的，并且常用于膳食和低热量产品，包括食品和饮料。高强度甜味剂不会引起升胰岛素响应，使得它们适用于目标在于糖尿病的产品和其他有益于控制其糖类摄入的产品。
[0004]甜菊糖苷为南美某些地区土生土长的菊科(Asteraceae)(菊科(Compositae))的多年生灌木甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)叶中发现的一类化合物。它们的结构特征在于单碱基甜菊醇，其区别在于在C13和C19位置处存在糖类残基。它们蓄积在甜菊属(Stevia)叶中，占总干重的大约10％-20％。基于干重，在甜菊属叶中发现的4种主要糖苷典型地包括甜菊苷(9.1％)，瑞鲍迪苷A(3.8％)，瑞鲍迪苷C(0.6-1.0％)和杜克苷A(0.3％)。其他已知的甜菊糖苷包括瑞鲍迪苷B，C，D，E，F和M，甜菊双糖苷和甜茶苷。
[0005]尽管已知由甜叶菊制备甜菊糖苷的方法，但是这些方法中的许多在商业上不适用。
[0006]因此，仍然需要简单，有效和具有经济性的用于制备包含甜菊糖苷的组合物(包括高度纯化的甜菊糖苷组合物)的方法。
[0007]专利技术概述
[0008]本专利技术提供了用于制备包含目标甜菊糖苷的组合物的方法，所述方法通过使包含有机底物的起始组合物与微生物细胞和/或酶制剂接触来进行，由此产生包含目标甜菊糖苷的组合物。
[0009]起始组合物可以为包含至少一个碳原子的任意有机化合物。在一个实施方案中，起始组合物选自甜菊糖苷，多元醇或糖醇，各种糖类。
[0010]目标甜菊糖苷可以为任意甜菊糖苷。在一个实施方案中，目标甜菊糖苷为甜菊单糖苷，甜菊单糖苷A，甜菊双糖苷，甜菊双糖苷A，甜菊双糖苷B，甜茶苷，甜菊苷，甜菊苷A(瑞鲍迪苷KA)，甜菊苷B，甜菊苷C，瑞鲍迪苷E，瑞鲍迪苷E2，瑞鲍迪苷E3，瑞鲍迪苷AM或合成甜菊糖苷。
[0011]在一个实施方案中，目标甜菊糖苷为瑞鲍迪苷AM。
[0012]在一些优选的实施方案中，使用包含一种或多种酶的酶制剂或包含一种或多种酶的微生物细胞，其能够将起始组合物转化为目标甜菊糖苷。所述酶可以位于细胞表面上和/或其内部。所述酶制剂可以以完整细胞混悬液，粗的裂解物或作为纯化的酶提供。该酶制剂可以为游离形式或固定在由无机物或有机物制成的固体支持物上。
[0013]在一些实施方案中，微生物细胞包含将起始组合物转化为目标甜菊糖苷的必不可少的酶和编码它们的基因。因此，本专利技术还提供了用于制备包含目标甜菊糖苷的组合物的方法，所述方法通过使包含有机底物的起始组合物包含至少一种酶的微生物细胞接触来进行，所述至少一种酶能够将起始组合物转化为目标甜菊糖苷，由此产生包含至少一种目标
甜菊糖苷的介质。
[0014]将起始组合物转化为目标甜菊糖苷必不可少的酶包括甜菊醇生物合成酶，UDP-葡糖基转移酶(UGT)和/或UDP-再循环酶。
[0015]在一个实施方案中，甜菊醇生物合成酶包括甲羟戊酸(MVA)途径酶。
[0016]在另一个实施方案中，甜菊醇生物合成酶包括非甲羟戊酸2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径(MEP/DOXP)酶。
[0017]在一个实施方案中，甜菊醇生物合成酶选自：香叶基香叶基二磷酸合酶，柯巴基二磷酸合酶(copalyl diphosphate synthase)，贝壳杉烯合酶，贝壳杉烯氧化酶，贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)，甜菊醇合成酶，脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)，D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)，4-二磷酸胞嘧啶基(diphosphocytidyl)-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)，4-二磷酸胞嘧啶基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)，4-二磷酸胞嘧啶基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(MCS)，l-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(HDS)，l-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶(HDR)，乙酰乙酰基-CoA硫解酶，截短型HMG-CoA还原酶，甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸激酶，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶，细胞色素P450还原酶等。
[0018]UDP-葡糖基转移酶可以为任意UDP-葡糖基转移酶，其能够将至少一个葡萄糖单元添加到甜菊醇和/或甜菊糖苷底物上，以提供目标甜菊糖苷。
[0019]如下文所用，除非另有指定，否则术语“SuSy_AT”是指具有如实施例1中所述的氨基酸序列“SEQ ID 1”的蔗糖合酶。
[0020]如下文所用，除非另有指定，否则术语“UGTSl2”是指具有如实施例1中所述的氨基酸序列“SEQ ID 2”的UDP-葡糖基转移酶。
[0021]如下文所用，术语“UGT76G1”除非另有指定，否则是指具有如实施例1中所述的氨基酸序列“SEQ ID 3”的UDP-葡糖基转移酶。
[0022]在一个实施方案中，甜菊醇生物合成酶和UDP-葡糖基转移酶在微生物细胞中产生。微生物细胞可以为，例如大肠杆菌(E.coli)，酵母属(Saccharomyces sp.)，曲霉属(Aspergillus sp.)，毕赤酵母属(Pichia sp.)，芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，耶罗威亚酵母属(Yarrowia sp.)等。在另一个实施方案中，合成了UDP-葡糖基转移酶。
[0023]在一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶选自：UGT74G1，UGT85C2，UGT76G1，UGT91D2，UGTSl2，EUGT11和UGT，其具有与这些多肽具有显著(>85％，>86％，>87％，>88％，>89％，>90％，>91％，>92％，>93％，>94％，>95％，>96％，>97％，>98％，>99％)氨基酸序列同一性；以及编码这些UGT的分离的核酸分子。
[0024]在一个实施方案中，甜菊醇生物合成酶，UGT和UDP-葡萄糖再循环系统存在于一种微生物(微生物细胞)中。微生物可以为，例如大肠杆菌，酵母属，曲霉属，毕赤酵母属，芽孢杆菌属，耶罗威亚酵母属。
[0025]在一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶为任意UDP-葡糖基转移酶，其能够将至少一个葡萄糖单元添加到甜菊醇上或在C13处具有-OH官能团的任意起始甜菊糖苷上，得到在C13处具有-O-葡萄糖β吡喃葡萄糖苷的糖苷键的目标甜菊糖苷。在一个具体的实施方案中，UDP-葡糖基转移酶为UGT85C2或与UGT85C2具有>85％的氨基酸序列同一性的UGT。
[0026]在另一个实施方案中，UDP-葡糖本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.具有下式的瑞鲍迪苷AM：2.用于生产高度纯化的权利要求1的瑞鲍迪苷AM的方法，包括下列步骤：a.提供包含具有至少一个碳原子的有机化合物的起始组合物；b.提供选自酶制剂、细胞或微生物的生物催化剂；所述生物催化剂包含至少一种能够将所述起始组合物转化为瑞鲍迪苷AM的酶；c.使所述生物催化剂与含有所述起始组合物的介质接触，产生包含瑞鲍迪苷AM的介质。3.权利要求2的方法，还包括下列步骤：d.从所述介质中分离瑞鲍迪苷AM，提供高度纯化的瑞鲍迪苷AM组合物。4.权利要求2的方法，其中所述起始组合物选自甜菊醇，甜菊单糖苷，甜菊单糖苷A，甜菊双糖苷，甜菊双糖苷A，甜菊双糖苷B，甜茶苷，甜菊苷，甜菊苷A(瑞鲍迪苷KA)，甜菊苷B，甜菊苷C，瑞鲍迪苷E，瑞鲍迪苷E2，瑞鲍迪苷E3，其他甜菊糖苷，多元醇，糖类及其组合。5.权利要求2的方法，其中所述微生物选自大肠杆菌(E.coli)，酵母属(Saccharomyces sp.)，曲霉属(Aspergillus sp.)，毕赤酵母属(Pichia sp.)，芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和耶罗威亚酵母属(Yarrowia sp.)。6.权利要求2的方法，其中所述酶选自：甜菊醇生物合成酶，UDP葡糖基转移酶，UDP葡萄糖再循环酶，甲羟戊酸(MVA)途径酶，2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径(MEP/DOXP)酶，香叶基香叶基二磷酸合酶，柯巴基二磷酸合酶，贝壳杉烯合酶，贝壳杉烯氧化酶，贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)，甜菊醇合成酶，脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)，D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)，4-二磷酸胞嘧啶基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)，4-二磷酸胞嘧啶基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)，4-二磷酸胞嘧啶基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(MCS)，l-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(HDS)，l-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶(HDR)，乙酰乙酰基-CoA硫解酶，截短型HMG-CoA还原酶，甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸激酶，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶，细胞色素P450还原酶，UGT74G1，UGT85C2，UGT91D2，EUGT11，UGTSl2，UGT76G1或其具有>85％氨基酸序列同一性，>86％氨基酸序列同一性，>87％氨基酸序列同一性，>88％氨基酸序列同一性，>89％氨基酸序列同一性，>90％氨基酸序列同一性，>91％氨基酸序列同一性，>92％氨基酸序列同一性，>93％氨基酸序列
同一性，>94％氨基酸序列同一性，>95％氨基酸序列同一性，>96％氨基酸序列同一性，>97％氨基酸序列同一性，>98％氨基酸序列同一性，>99％氨基酸序列同一性的突变变体；及其组合。7.权利要求3的方法，其中高度纯化的瑞鲍迪苷AM组合物中瑞鲍迪苷AM含量基于干重大于约95％重量。8.消费产品，包含权利要求1的瑞鲍迪苷AM，其中所述产品选自食品，饮料，药物组合物，烟草产品，营养保健品组合物，口腔卫生组合物和化妆品组合物。9.权利要求8的消费产品，还包含至少一种添加剂，其选自糖类，多元醇，氨基酸及其相应的盐，聚氨基酸及其相应的盐，糖酸及其相应的盐，核苷酸，有机酸，无机酸，有机盐，包括有机酸盐和有机碱盐，无机盐，苦味化合物，咖啡碱，香料和调味剂成分，收敛化合物，蛋白质或蛋白水解产物，表面活性剂，乳化剂，类黄酮，醇，聚合物及其组合。10.权利要求8的消费产品，还包含至少一种功能性成分，其选自皂苷，抗氧化剂，膳食纤维源，脂肪酸，维生...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：谱赛科美国股份有限公司，
类型：发明
国别省市：