稳定的杂合FC融合G-CSF制剂制造技术

本发明专利技术包含稳定形式的杂合Fc融合的粒细胞集落刺激因子(G

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】20080766022，US 8586038B2)。出于此目的，不具有ADCC和CDC应答的两种不同的免疫球蛋白在遗传上被组合。杂合Fc衍生自人IgG亚类的组合或人IgD和IgG的组合。当杂合Fc与生物活性分子连接时，杂合Fc有效地增加生物活性分子的血清半衰期，以及在当编码Fc多肽融合蛋白的核苷酸表达时提高多肽表达水平。因此，杂合Fc(hyFc)融合的G-CSF还具有更长的血浆半衰期、高效的表达水平、消除的细胞毒性和降低的免疫原性(US8586048B2)。在这方面，hy-Fc融合的G-CSF是独特的且是起源分子，其中Fc部分本身是两种免疫球蛋白分子的融合物，并且该第一融合物进一步与活性分子融合。由于该结构需要注意Fc融合部分和G-CSF部分二者的稳定性，它不同于其他常规的Fc融合药物，并且需要额外不同且独特的溶液用于建立其稳定性。在这方面，对于本专利技术，完成关于常规Fc融合蛋白的稳定性的文献研究，但是本专利技术本身是根据这种独特的hy-Fc融合的G-CSF的特定需要而完成的。
[0013]文献综述完成后，针对常规的Fc融合的药物存在不同的制剂溶液。重组抗体和Fc缀合的蛋白的多种生物物理和化学特性需要pH(4.0-8.5)、缓冲剂(乙酸盐，柠檬酸盐，磷酸盐)、稳定剂(盐，糖，氨基酸)和/或表面活性剂(聚山梨酯20和聚山梨酯80)的处于液体和冻干形式的制剂，以在存储期间保护它们的完整性和功效(S.M.Chamow,T.Ryll,B.H Lowman,和D.Farson,Eds.,Therapeutic Fc-Fusion Proteins,Wiley-Blackwell:Hoboken,NJ,2014)。
[0014]不同于被Fc和Fab结构域的结构域间和结构域内相互作用稳定的完整单克隆抗体(mAb)；由于缺失的结构域间稳定性，Fc缀合物是相对不稳定的(A L Nelson.,Antibody fragments,MAbs.2010Jan-Feb；2(1):77-83)。此外，最主要的情况是存在Fc融合蛋白的不止一个降解途径。通常，虽然一种使针对一种降解途径的分子稳定化的配制条件可能会刺激另一种降解途径。因此，为Fc融合蛋白药物建立理想的制剂组合物是既相当具有重要性又相当具有挑战性的。
[0015]制剂开发需要确定分子的物理和化学降解途径。一旦确定了关键的降解途径，制剂科学家的目的是开发制剂缓冲剂的理想组合物，其包含缓冲剂、稳定剂和/或表面活性剂。
[0016]Fc融合蛋白针对化学和物理降解的稳定性通常在狭窄的pH范围内最大化(S.M.Chamow,T.Ryll,B.H Lowman,and D.Farson,Eds.,Therapeutic Fc-Fusion Proteins,Wiley-Blackwell:Hoboken,NJ,2014)。因此，筛选最佳pH非常重要。除pH值外，稳定剂如糖(蔗糖、海藻糖和/或多元醇)也是Fc-缀合物制剂的重要组分(Gokarn et al.Excipients for Protein Dugs,Excipient Development for Pharmaceutical,Biotechnology,and Drug Delivery,2006)。另外，表面活性剂，例如聚山梨酯，在蛋白质制剂中也起重要作用。它们是与蛋白质结合竞争界面的表面活性剂，因此降低界面张力及其对蛋白质结构的危害(T.A.Khan,H-C.Mahler,R.S.K.Kishore,Eur.J.Pharm.Biopharm；2015Nov 97:60-67)。
[0017]已知在基于蛋白质的疗法中的聚集发生在以下的每个阶段：产生、配制、储存、运输并且甚至在施用期间。照此蛋白质聚集对生物制药业来说是相当重大的问题，且尽管近年来取得巨大技术上进步；它仍然持续是发展的主要障碍。因此，预测、最小化、限制和/或逆转蛋白质聚集的能力对于生物治疗药物的可行制造和配制至关重要。不幸地，对聚集的控制是一个相当大的挑战，因为聚集机制遵循许多途径。虽然已经积累很多聚集机制的知
识，目前还不可能可靠地预测蛋白质的聚集倾向。然而，目前的聚集模型已经确定控制稳定性的两个因素：一个是胶态稳定性，并且另一个是构象稳定性。
[0018]胶态稳定性取决于溶液中蛋白质分子间的排斥的和吸引的分子间相互作用的平衡。构象稳定性被定义为蛋白质分子在折叠态和非折叠态之间自由能中的差异。因此，目前用于预测蛋白质聚集倾向的技术是基于对构象稳定性和胶态稳定性的评估。这些包括基于在电脑中序列/结构的预测和对作为构象稳定性指标的聚集起始(T
m
)的测定以及对作为胶态稳定性的量度的渗透第二维里系数(A2)的测定。
[0019]为了本专利技术，针对独特的且起源药物分子hy-Fc融合的G-CSF的特定需求进行了系统性研究。为了提供允许能够保留活性物质的化学和生物物理完整性的具有稳定的液体制剂的长效G-CSF缀合物，专利技术了包含处于一定pH范围中的缓冲剂、稳定剂、表面活性剂和/或有机部分的制剂。
[0020]在本专利技术中，基于色谱纯度和电泳纯度、A2、和T
onset
值评估了杂合Fc融合的G-CSF的稳定制剂，并且选择这些稳定的制剂。用实例证明所选制剂的长期稳定性。
[0021]对问题的描述
[0022]将如本文所述的制剂类型开发成融合的药物是特别的挑战，其中平台需要与所融合的活性物质之一不同的化学或生物物理稳定性比率。在本专利技术中，还应注意，hy-Fc融合平台(EP 20080766022，US 8586038B2)是独特的且是起源分子，并且与其他常规Fc平台不同，因此需要不同的溶液用于建立其稳定性。特别地，其他常规Fc平台通常包括IgG2或类似的免疫球蛋白的Fc区，并且药物与该单个免疫球蛋白的Fc区直接融合。然而，hy-Fc平台是IgD和IgG亚类的组合，其中免疫球蛋白Fc部分本身形成融合物，并且药物与该免疫球蛋白部分的融合物构成第二融合物。在这方面，本文解释的所有专利技术对所描述的hy-Fc-G-CSF药物是完全特异的，并且已经根据对该独特分子的稳定性的特定需求进行了开发(US 8586048B2)。
[0023]为了在本专利技术中使用，hy-Fc平台和G-CSF具有人源化生物体的氨基酸序列。没有使用额外的融合反应，因为在IgD和IgG之间以及在G-CSF和免疫球蛋白部分之间的融合物是通过单一遗传密码和单一转录-翻译反应提供的。G-CSF和hy-Fc平台之间的肽键是经由脯氨酸-精氨酸的。hy-Fc融合的G-CSF单体的氨基酸序列如下。信号、G-CSF、N-末端和hv-Fc序列以相应的格式表示。hy-Fc融合的G-CSF的示意性蛋白质结构如图1所示。
[0024][0025]在本专利技术中发现，分子的稳定性主要受G-CSF连接位点处在较低pH值(pH<5.0)下的水解以及在高pH值(pH>6.5)下二硫化物改组(shuffling)的影响并且倾向于在G-CSF连
接位点处在较低pH值(pH&a本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种稳定的杂合Fc融合G-CSF制剂，其包含治疗有效量的杂合Fc融合G-CSF，其中所述制剂的pH值在3.8和6.5之间。2.根据权利要求1所述的制剂，优选地所述制剂的pH值在4.0和4.6之间。3.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含至少一种稳定剂、缓冲剂系统和至少一种表面活性剂。4.根据权利要求3所述的制剂，其中所述缓冲剂选自由以下组成的组：乙酸盐、磷酸盐、甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、三-(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)缓冲剂或其组合。5.根据权利要求4所述的制剂，其中所述缓冲剂系统包含三水乙酸钠和乙酸/氢氧化钠。6.根据权利要求3所述的制剂，其中所述稳定剂选自由以下组成的组：山梨糖醇、甘露糖醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇或其组合。7.根据权利要求6所述的制剂，所述稳定剂是山梨糖醇。8.根据权利要求7所述的制剂，其中基于所述制剂的总体积，所述山梨糖醇的浓度为从3.0w/v％至7.0w/v％。9.根据权利要求7所述的制剂，其中山梨糖醇与蛋白质的重量比在3:2至7:2之间。10.根据权利要求9所述的制剂，其中山梨糖醇与蛋白质的重量比优选是5:2。11.根据权利要求3所述的制剂，其中所述非离子型表面活性剂是基于聚山梨酯或基于泊洛沙姆的非离子型表面活性剂，所述非离子型表面活性剂选自由以下组成的组：泊洛沙姆188、聚山梨酯20和聚山梨酯80或其组合。12.根据权利要求11所述的制剂，其中所述表面活性剂是泊洛沙姆188。13.根据权利要求12所述的制剂，其中基于液体制剂的总体积，泊洛沙姆188的浓度为从0.08w/v％至0.15w/v％。14.根据权利要求1所述的制剂，其中杂合Fc融合的G-CSF的浓度在从10mg/mL至80mg/mL的范围内。15.根据权利要求14所述的制剂，其中杂合Fc融合的G-C...

【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：伊尔科根医药工业和贸易有限公司，
类型：发明
国别省市：