一种TaqMan探针荧光定量PCR检测软疣病毒的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种软疣病毒实时荧光定量PCR试剂盒，包括实时荧光PCR检测引物对和探针；所述引物对包括：上游引物如SEQ ID NO.1所示的序列；下游引物如SEQ ID NO.2所示的序列；所述探针的序列为如SEQ ID NO.3所示的序列，所述探针5

【技术实现步骤摘要】
一种TaqMan探针荧光定量PCR检测软疣病毒的方法及应用


[0001]本专利技术涉及微生物分子检测领域，尤其涉及一种软疣病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒。

技术介绍

[0002]传染性软疣病毒(Molluscum contagiosum virus，MCV)是痘病毒科中以人为惟一宿主的另一类病毒。该病毒通过接触传染，感染人后在皮肤上产生良性的肿瘤样病变。主要感染儿童和青年人，也可以通过性接触在成人中传播。在免疫缺陷的病人中通常导致严重感染，常规治疗难以治愈。痘病毒科病毒感染后传染性强，危害性各异，但临床表现均出现皮肤损害，不易区分且容易引起恐慌。传统检测病毒的方法在一定程度上是有效的，但是它们也有不足的地方，如病毒的分离培养，是需要耗费大量人力、物力和时间的，抗体检测对一些临床样本缺乏足够的灵敏度，有时不能判定出一些正常个体中的潜伏感染。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种软疣病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，更够快速、准确且灵敏地同时检测出软疣病毒，特异性强、灵敏度高。
[0004]本专利技术是这样实现的：
[0005]本专利技术目的之一在于提供一种软疣病毒实时荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包括实时荧光PCR检测引物对和探针；
[0006]所述引物对包括：上游引物如SEQ ID NO.1所示的序列；下游引物如SEQ ID NO.2所示的序列；
[0007]所述探针的序列为如SEQ ID NO.3所示的序列，所述探针5/>’
端标记荧光基团，3
’
端标记荧光淬灭基团。
[0008]优选地，所述探针的5
’
端标记的荧光基团为有机荧光染料或量子点无机染料中的任一种，所述探针3
’
端标记猝灭基团为有机染料的任一种或者金纳米粒子。所述有机荧光染料为FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red，所述有机猝灭染料为TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。
[0009]优选地，所述试剂盒还包括：Enzyme Mix、5
×
PCR Buffer，标准品，对照品。所述阳性标准品为软疣病毒标准品；所述阴性对照品：RNase Free H2O。
[0010]本专利技术目的之二在于提供一种软疣病毒的实时荧光PCR检测方法，利用所述的软疣病毒实时荧光PCR检测试剂盒进行实时荧光PCR扩增。
[0011]优选地，所述方法具体包括如下步骤：
[0012]步骤1、从样品中提取DNA为模板；
[0013]步骤2、以所述DNA为模板，利用所述的实时荧光PCR检测试剂盒进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线；
[0014]步骤3、对所述扩增曲线进行分析，并做出判断。
[0015]优选地，所述步骤2中扩增的反应体系具体包括：权利要求1所述的软疣病毒的实时荧光PCR检测引物对和探针、5
×
PCR Buffer和Enzyme Mix；扩增程序为：95度2min；95度15sec、60度1min，40个循环。
[0016]优选地，所述步骤3中具体判断规则为：
[0017]当Ct≤35时，判断样品为软疣病毒阳性；
[0018]当35<Ct≤40时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于35就判断样品为软疣病毒阳性，否则判断样品为软疣病毒阴性；
[0019]当无扩增曲线时，判断样品为软疣病毒阴性。
[0020]本专利技术具有以下有益效果：
[0021]本专利技术提供的软疣病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，更够快速、准确且灵敏地同时检测出软疣1型和软疣2型病毒，具有特异性强、重复性好、敏感性高、操作简便、耗时短和无污染等优点。具体地：(1)具有良好的特异性，且批内、批间重复性试验结果的变异系数均小于2％，具有良好的重复性；(2)灵敏度大大提高，最小检出浓度为2.87
×
102拷贝/μL，是普通PCR的1000倍；(3)检测快速，整个反应过程从待检品提取DNA到结果分析只要1.5h；(4)同时避免了后续电泳等步骤且整个反应过程为闭管操作，减少了污染和人为操作带来的误差，不仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。
附图说明
[0022]图1为PCR扩增产物电泳图；
[0023]图2为标准品实时荧光定量PCR原始扩增曲线；
[0024]图3为标准品实时荧光定量PCR标准曲线；
[0025]图4为实时荧光定量PCR特异性试验图；
[0026]图5是10份MCV阳性样本、阳性对照、阴性对照的荧光定量PCR扩增曲线；
[0027]图6是5份MCV阳性样本、4个标准品、阳性对照、阴性对照的荧光定量PCR扩增曲线；
具体实施方式
[0028]实施例1
[0029]实施例1软疣病毒的实时荧光PCR试剂盒
[0030]1、试剂盒的组成
[0031]本试剂盒包括软疣病毒的一对特异性引物(F和R)、一条特异性荧光探针(FP)、阳性对照、阴性对照、5
×
PCR Buffer和Enzyme Mix；
[0032]①
软疣病毒的一对特异性引物(上游引物和下游引物如表1所示)
[0033]②
软疣病毒的一条特异性荧光探针(如表1所示)
[0034]本实施例中荧光探针5
’
端标记荧光报告基团FAM，3
’
端标记荧光淬灭基团BQ1；在其他实施例中也可以选择其他荧光报告基团，其他荧光淬灭基团。具体地，所述荧光报告基团也可替换为VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red，所述荧光淬灭基团也可替换为TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-2和BHQ-3。
[0035]表1
[0036][0037]③
阳性对照
[0038]软疣病毒标准品；
[0039]④
阴性对照
[0040]RNase Free H2O；
[0041]⑤5×
PCR Buffer配制：
[0042][0043][0044]配置混合后于冰箱-20℃保存；
[0045]⑥
Enzyme Mix配制：
[0046][0047]配置混合后于冰箱-20℃保存。
[0048]实施例2软疣病毒的实时荧光检测方法
[0049]1、病毒核酸的提取
[0050]①
首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA；
[0051]②
取30μl蛋白酶放入1.5ml离心管中；
[0052]③
将标本取200μl加入此管中，充分混本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种软疣病毒实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括实时荧光PCR检测引物对和探针；所述引物对包括：上游引物如SEQ ID NO.1所示的序列；下游引物如SEQ ID NO.2所示的序列；所述探针的序列为如SEQ ID NO.3所示的序列，所述探针5
’
端标记荧光基团，3
’
端标记荧光淬灭基团；该引物和探针组合扩增的产物序列如SEQ ID NO.4所示。2.如权利要求1所述的软疣病毒实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述探针的5
’
端标记的荧光基团为有机荧光染料或量子点无机染料中的任一种，所述探针3
’
端标记猝灭基团为有机染料的任一种或者金纳米粒子。3.如权利要求2所述的软疣病毒实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述有机荧光染料为FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red，所述有机猝灭染料为TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。4.如权利要求1所述的软疣病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：Enzyme Mix、5
×
PCR Buffer，标准品，对照品。5.如权利要求4所述的软疣病毒实时荧光定量...

【专利技术属性】
技术研发人员：张祺，刘芳，刘映乐，邬开朗，张艳，朱莹，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：