单域抗体-胞嘧啶脱氨酶融合蛋白制造技术

本公开涉及融合蛋白、制备融合蛋白的方法以及使用融合蛋白的方法，其中所述融合蛋白包含：单域抗体(sdAb)或其功能性变体、和胞嘧啶脱氨酶(CD)蛋白或其功能性变体，二者可选地经肽接头连接。本公开的融合蛋白还具有CD活性。本公开还涉及包含所述融合蛋白和药学可接受的赋形剂的药物组合物或制剂、以及这些融合蛋白的医药用途。白的医药用途。白的医药用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单域抗体-胞嘧啶脱氨酶融合蛋白
[0001]相关申请
[0002]本申请要求提交于2018年01月04日的美国临时申请第62/613,653号的优先权。
[0003]电子提交的序列表的援引
[0004]以创建于2019年1月3日的大小为385,759字节的文件名为13075_0003_SL.txt的ASCII格式序列表经EFS-Web电子提交了序列表的官方副本。该ASCII格式文件所包含的序列表是说明书的一部分，且在本文通过援引以其整体并入。


[0005]本公开涉及融合蛋白、制备融合蛋白的方法和使用融合蛋白的方法。更具体地，本公开涉及包含：针对细胞蛋白的功能性单域抗体(sdAb)(例如，VHH或纳米抗体)或其功能性变体；和胞嘧啶脱氨酶(CD)蛋白或其功能性变体的融合蛋白，二者可选地经肽接头连接。所述sdAb或其功能性变体可连接(可选地经肽接头)至CD蛋白或其功能性变体的N端或C端。本公开的融合蛋白还具有CD活性。本公开还涉及包含这类融合蛋白和药学可接受的赋形剂的药物组合物或制剂，以及这些融合蛋白的医药用途。

技术介绍

[0006]化疗药5-氟尿嘧啶(5-FU)广泛用于癌症治疗中，但采用5-FU的全身性治疗与严重毒性副作用相关。该试剂通过干扰转录而抑制细胞生长，且可以用在癌症和其它增殖性疾病的治疗中。胞嘧啶脱氨酶(CD)将非毒性前药5-氟胞嘧啶(5-FC)转化为细胞毒性剂5-氟尿嘧啶。5-FC因人类细胞中缺乏CD而对人体细胞无毒性。与5-氟胞嘧啶前药共同施用的胞嘧啶脱氨酶基因是癌症基因疗法中最广泛测试的自杀体系中的一种。在对受试者的5-FC治疗后，CD基因在肿瘤内的表达能够诱导5-氟尿嘧啶的局部生成，从而产生肿瘤内化疗。将5-FC的施用和CD相组合往往与全身性毒性相关。因此，需要在增殖性疾病的治疗中利用CD/5-FC组合策略的替代性手段。
[0007]已开发了抗体导向的酶-前药疗法(ADEPT)来克服该限制。与肿瘤特异性抗体缀合的活化性酶被递送至肿瘤细胞内，随后施用前药，该前药在被所述酶活化前是惰性的。因此，可以避免全身性毒性。
[0008]Park等公开了含有TSG-6(Link)的透明质酸结合域和酵母菌胞嘧啶脱氨酶(CD)的重组融合蛋白。在他们的研究中，在BL21-Codon(DE3)RIPL大肠杆菌细胞中表达了各种Link-CD构建体，例如GST-标签、(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:188)接头。虽然努力增加可溶性蛋白的积累，但大多数表达的蛋白在包涵体(inclusion body)内聚集。平均而言，从每升培养基的可溶性级分中回收了约500μg/L的纯化蛋白(Mol Pharm.2009；6(3):801
–
812)。
[0009]Deckert等公开了A33scFv-胞嘧啶脱氨酶重组蛋白并证明了其抗原结合特异性及酶活性。利用BL21大肠杆菌λDE3溶源体(lysogen)通过T7-RNA聚合酶控制的细菌体系表达A33scFv-CD。融合蛋白作为包涵体以约100μg/L最终培养物产量表达(British Journal of Cancer(2003)88,937
–
939)。
[0010]在单一表达体系中表达由人抗体序列和细菌酶组成的异种蛋白是困难的。Coelho等试图在毕赤酵母(Pichia pastoris)中产生A33scFv-胞嘧啶脱氨酶重组蛋白以选择高产量克隆进行生产。在其研究中，选择了pPICZαA-转殖的高产量毕赤酵母克隆，且目标蛋白可以分泌至培养上清液中。纯化后的总产量为约1.0mg/L(International Journal of Oncology 31:951-957,2007)。
[0011]这些结果均指明，肿瘤特异性抗体或抗原结合片段与CD的融合不适合工业生产。因此，需要对于工业用途具有可观的生产产量并且展示出抗原结合特异性和酶活性的CD融合蛋白。

技术实现思路

[0012]本公开提供了融合蛋白、制备融合蛋白的方法以及使用融合蛋白的方法。以下是本公开的非限制性实施方式。
[0013]在本公开的某些实施方式中，融合蛋白包含式I或式II：
[0014]N-(L)n-C(式I)；
[0015]C-(L)n-N(式II)；
[0016]其中，N为单域抗体(sdAb)或其功能性变体，L为肽接头且n＝0-50，并且C为胞嘧啶脱氨酶(CD)蛋白或其功能性变体。
[0017]在这些实施方式的某些方面，融合蛋白包含式I并且肽接头的C端或sdAb或其功能性变体的C端与CD蛋白或其功能性变体的N端融合。例如，在某些方面，不存在肽接头，且sdAb或其功能性变体的C端与CD蛋白或其功能性变体的N端融合。在某些方面，存在至少一个肽接头，且sdAb或其功能性变体的C端与肽接头的N端融合，而肽接头的C端与另一个肽接头的N端或者CD蛋白或其功能性变体的N端融合。
[0018]在这些实施方式的其它方面，融合蛋白包含式II并且肽接头的C端或CD蛋白或其功能性变体的C端与sdAb或其功能性变体的N端融合。例如，在某些方面，不存在肽接头，且CD蛋白或其功能性变体的C端与sdAb或其功能性变体的N端融合。在某些方面，存在至少一个肽接头，且CD蛋白或其功能性变体的C端与肽接头的N端融合，而肽接头的C端与另一个肽接头的N端或者sdAb或其功能性变体的N端融合。
[0019]在某些实施方式中，融合蛋白基本由式I组成。在某些实施方式中，融合蛋白是式I。
[0020]在某些实施方式中，融合蛋白基本由式II组成。在某些实施方式中，融合蛋白是式II。
[0021]在某些实施方式中，sdAb或其功能性变体与靶标结合，其中所述靶标选自由细胞膜分子、分泌的分子和细胞内分子组成的组。在某些实施方式中，所述靶标是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。
[0022]在某些实施方式中，所述靶标选自由以下组成的组：EGFR、5T4、A33、AFP、β-连环蛋白、BRCA1、BRCA2、C242、CCR4、CD152、CD19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23、CD30、CD3、CD37、CD40、CD44、CD5、CD51、CD52、CD56、CD64、CD74、CD80、CDCP1、c-KIT、COX-2、cMET、CSF1R、CTLA-4、EGF2、ErbB2、ErbB3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、HER2、HER3、HIF-Ia、HLA-DR、IGF-IR、mTOR、NPC-1C、P53、PDGFRα、PDGFRβ、PLGF、PSA、RGMa、RoN、TNF、TP53、TPD52、VEGFR1、
VEGFR2、VEGFR3、CA-IX、αvβ3、α5β1、FAP、糖蛋白75、TAG-72、MUC16、NR-LU-13、SLAMF7、EGP40、BAFF、PRL-3、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性膜抗原、MART-1、gp100、癌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】ID NO:29、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:35组成的组的互补决定区2(CDR2)；和选自由SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:36组成的组的互补决定区3(CDR3)。15.如权利要求14所述的融合蛋白，其中，所述sdAb或其功能性变体包含SEQ ID NO:23(3VGR19)的氨基酸序列。16.如权利要求14所述的融合蛋白，其中，所述sdAb或其功能性变体包含SEQ ID NO:24(4VGR17)的氨基酸序列。17.如权利要求14所述的融合蛋白，其中，所述sdAb或其功能性变体包含SEQ ID NO:25(4VGR38)的氨基酸序列。18.如权利要求11或13所述的融合蛋白，其中，所述sdAb或其功能性变体包含选自由SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:40组成的组的CDR1、选自由SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:41组成的组的CDR2以及选自由SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:42组成的组的CDR3。19.如权利要求18所述的融合蛋白，其中，所述sdAb或其功能性变体包含SEQ ID NO:26(VHH122)的氨基酸序列。20.如权利要求18所述的融合蛋白，其中，所述sdAb或其功能性变体包含SEQ ID NO:27(7D12)的氨基酸序列。21.如权利要求11所述的融合蛋白，其中，所述sdAb或其功能性变体包含：选自由SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:202和SEQ ID NO:205组成的组的CDR1；选自由SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:203和SEQ ID NO:206组成的组的CDR2；和选自由SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:204和SEQ ID NO:207组成的组的CDR3。22.如权利要求21所述的融合蛋白，其中，所述sdAb或其功能性变体包含SEQ ID NO:69(2D3)的氨基酸序列。23.如权利要求21所述的融合蛋白，其中，所述sdAb或其功能性变体包含SEQ ID NO:70(5F7)的氨基酸序列。24.如权利要求21所述的融合蛋白，其中，所述sdAb或其功能性变体包含SEQ ID NO:71(47D5)的氨基酸序列。25.如权利要求11所述的融合蛋白，其中，所述sdAb或其功能性变体包含SEQ ID NO:208的CDR1、SEQ ID NO:209的CDR2和SEQ ID NO:210的CDR3。26.如权利要求25所述的融合蛋白，其中，所述sdAb或其功能性变体包含SEQ ID NO:75(BCD090-M2)的氨基酸序列。27.如权利要求11所述的融合蛋白，其中，所述sdAb或其功能性变体包含：选自由SEQ ID NO:211和SEQ ID NO:214组成的组的CDR1；选自由SEQ ID NO:212和SEQ ID NO:215组成的组的CDR2；和选自由SEQ ID NO:213和SEQ ID NO:216组成的组的CDR3。28.如权利要求27所述的融合蛋白，其中，所述sdAb或其功能性变体包含SEQ ID NO:77(ABS29544.1)的氨基酸序列。29.如权利要求27所述的融合蛋白，其中，所述sdAb或其功能性变体包含SEQ ID NO:79(NbCEA5)的氨基酸序列。30.如权利要求1或3-29中任一项所述的融合蛋白，其中，至少一个肽接头包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:188的氨基酸序列。31.如权利要求1-30中任一项所述的融合蛋白，其中，所述CD蛋白或其功能性变体是：
sdAb或其功能性变体、和CD蛋白或其功能性变体。41.如权利要求40所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:72,(ii)SEQ ID NO:72的第1-297位氨基酸，(iii)SEQ ID NO:73,(iv)SEQ ID NO:73的第1-291位氨基酸,(v)SEQ ID NO:74，和(vi)SEQ ID NO:74的第1-292位氨基酸。42.如权利要求1-11中任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含：抗-HER3 sdAb或其功能性变体、和CD蛋白或其功能性变体。43.如权利要求42所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:76，和(ii)SEQ ID NO:76的第1-300位氨基酸。44.如权利要求1-11中任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含：抗-CEA sdAb或其功能性变体、和CD蛋白或其功能性变体...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈佩君，李叔桦，
申请(专利权)人：顺天医药生技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：