一种表达黄绿荧光蛋白的生防菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种表达黄绿荧光蛋白的生防菌及其构建方法，涉及基因工程技术领域，所述生防菌为重组菌，宿主菌为野生型生防菌株BS‑17，宿主菌中转化有含黄绿荧光蛋白基因的穿梭质粒表达载体。构建的生防工程菌中带有基因标记的质粒稳定性较好，在应用中丢失可能性较小。生防工程菌对病原菌Fusarium oxysporum、Botrytis cinerea和Cladosporium fulvum的抑菌率与野生型菌株相当，无显著差异，该生防工程菌可以替代野生菌用于生防菌生防机制的研究。

【技术实现步骤摘要】
一种表达黄绿荧光蛋白的生防菌及其构建方法
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种表达黄绿荧光蛋白的生防菌及其构建方法与应用。
技术介绍
大量研究表明，生防菌在植物根围和叶围能否有效定殖是生防菌能否起到稳定持久防病效果的一个重要因素。其定殖能力受菌株自身的特性和周围环境中诸多因素的影响。由于植物体内存在内生细菌，植物表面和土壤中存在多种细菌，而这些细菌的菌落形态很难区别，由于受这些细菌的干扰，很难确定野生型的生防菌在植株根围和叶围的定殖情况。目前研究生防菌在植株根围和叶围的定殖，应用最多的方法是用利福平诱导抗性菌株，该方法需要逐步提高利福平的诱导浓度，耗时较长，并且获得性抗性菌株稳定性较差。用基因标记菌株进行生防菌定殖研究报道较少，田涛等人借助于荧光显微镜，定性研究了绿色荧光蛋白标记的生防芽孢杆菌在小麦根部能够定殖，该方法需特殊的仪器和较高的技术。生防菌在实际应用中会受到很多因素的影响，生防菌被引入土壤和叶面之后后，往往会受到原著菌群的抑菌作用以及生防菌与植物根部和叶部亲和能力的影响，这是导致生防菌在实际应用中防效不稳定的重要原因之一。因此，生防菌能否在靶植物根际和叶围定殖是生防菌能否发挥稳定作用的重要原因之一，也是筛选、评定生防菌的一个重要指标，并最终决定该生防菌是否具有产业化前景。研究生防菌的定殖及其对原著微生物的影响具有重要的理论意义和现实意义。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术采用SP盐方法将荧光蛋白基因导入野生型生防菌株中，通过菌体发荧光特性、质粒DNA双酶切和SDS-PAGE鉴定，获得1株具有较强荧光表型的基因标记菌株，并且提供了利用上述基因标记菌株研究研究生防菌在植株上的定殖的方法。首先，本专利技术提供一种表达黄绿荧光蛋白的生防菌，所述生防菌为重组菌，宿主菌为野生型生防菌株BS-17，宿主菌中转化有含黄绿荧光蛋白基因的穿梭质粒表达载体。所述野生型生防菌株BS-17在《生物技术》2011年第03期中公开，文章标题为《生防工程菌株BS-17A稳定性与抑菌活性初步研究》，作者于德水、高娃、沙长青、张淑梅、高继国。所述pHPS9质粒为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体，结构如图1所示，含有CmR基因、ORI332基因、PxylR基因、lacZ基因，从上游到下游依次的顺序为CmR基因、ORI332基因、PxylR基因、lacZ基因，lacZ基因在CmR基因的上游；所述EYFP基因为增强型黄绿荧光蛋白基因。所述含黄绿荧光蛋白基因的穿梭质粒表达载体，其结构为，在pHPS9质粒的lacZ基因和CmR基因之间的双酶切位点连接有EYFP基因。所述双酶切位点位于pHPS9质粒的lacZ基因下游，CmR基因上游。所述双酶切位点为BamHI酶切与EcoRI酶的双酶切位点。第二，本专利技术提供上述表达黄绿荧光蛋白的生防菌的构建方法，包括以下步骤：(1)将EYFP基因连接到pHPS9质粒的lacZ基因和CmR基因之间的双酶切位点，得到含黄绿荧光蛋白基因的穿梭质粒表达载体；(2)将步骤(1)所得的表达载体转化到野生型生防菌株BS-17中，即得到表达黄绿荧光蛋白的生防菌。步骤(1)所述双酶切位点位于pHPS9质粒的lacZ基因下游，CmR基因上游。所述pHPS9质粒为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体，结构如图1所示，含有CmR基因、ORI332基因、PxylR基因、lacZ基因，从上游到下游依次的顺序为CmR基因、ORI332基因、PxylR基因、lacZ基因，lacZ基因在CmR基因的上游；所述EYFP基因为增强型黄绿荧光蛋白基因。步骤(1)所述双酶切位点为BamHI酶切与EcoRI酶的双酶切位点。步骤(2)所述野生型生防菌株BS-17在《生物技术》2011年第03期中公开，文章标题为《生防工程菌株BS-17A稳定性与抑菌活性初步研究》，作者于德水、高娃、沙长青、张淑梅、高继国。第三，本专利技术还提供利用上述表达黄绿荧光蛋白的生防菌研究生防菌在植株上的定殖的方法，具体为：将所述表达黄绿荧光蛋白的生防菌按照待研究的生防菌施用方法对植物进行施用，检测施用部位生防菌的种群分布情况，定植的生防菌的种群数量越多、越稳定，该施用方法的定植效果越好，根据实际需求选择生防菌的使用方法。所述施用方法为浸种法、浇穴法或喷施方法。所述检测施用部位生防菌的种群分布情况，方法为：取待测植株用水洗净后，取待测施用部位，浸泡乙醇溶液，捞出沥干后放到灭菌的研钵中，加无菌水研磨，取研磨所得液体，涂布于加氯霉素的LB平板培养基上，每个待测施用部位样品涂3个平板，重复3次，30℃温箱中培养24～48h，计算每皿的菌落数，每种使用方法测定10株样本，取平均值算出每个植株不同部位的细菌种群数量。当施用方法为浸种法或浇穴时，所述待测施用部位为根部、茎基部或茎中部；当施用方法为喷施方法时，所述待测施用部位为叶片。所述乙醇溶液为70％wt的乙醇水溶液，浸泡乙醇溶液的时间为5min。所述LB平板培养基中包括：NaCl10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯霉素在其中的浓度我10μg/mL。所述表达黄绿荧光蛋白的生防菌的构建方法为：(1)将EYFP基因连接到pHPS9质粒的lacZ基因和CmR基因之间的双酶切位点，得到含黄绿荧光蛋白基因的穿梭质粒表达载体；(2)将步骤(1)所得的表达载体转化到野生型生防菌株BS-17中，即得到表达黄绿荧光蛋白的生防菌。步骤(1)所述双酶切位点位于pHPS9质粒的lacZ基因下游，CmR基因上游。所述pHPS9质粒为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体，结构如图1所示，含有CmR基因、ORI332基因、PxylR基因、lacZ基因，从上游到下游依次的顺序为CmR基因、ORI332基因、PxylR基因、lacZ基因，lacZ基因在CmR基因的上游；所述EYFP基因为增强型黄绿荧光蛋白基因。步骤(1)所述双酶切位点为BamHI酶切与EcoRI酶的双酶切位点。步骤(2)所述野生型生防菌株BS-17在《生物技术》2011年第03期中公开，文章标题为《生防工程菌株BS-17A稳定性与抑菌活性初步研究》，作者于德水、高娃、沙长青、张淑梅、高继国。有益效果本专利技术利用质粒载体上的氯霉素抗性基因作为筛选标记，排除土著杂菌的干扰，采用常规的细菌计数方法定量的研究了生防菌在番茄根围和叶围的定殖规律。该方法不需特殊仪器，而且重复性较好。浸种处理结果，生防菌在茎基部的定殖密度大于根部。浇穴处理表明生防菌在根部的定殖密度大于茎基部。这一结果可以为应用BS-17野生型菌株进行的棚室番茄枯萎病、灰霉病和叶霉病防效试验提供了理论依据，用生防菌液浸种、浇穴及喷洒处理对番茄枯萎病、灰霉病和叶霉病的防效高于单一浸种、单一浇穴和单一喷洒处理。本专利技术的研究表明，3种处理方法相结合对于生防菌在番茄根围和叶围的定殖具有增效作用，可以增加生防菌在根围合叶围的种群数量，有效抵御病原菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达黄绿荧光蛋白的生防菌，其特征在于：所述生防菌为重组菌，宿主菌为野生型生防菌株BS-17，宿主菌中转化有含黄绿荧光蛋白基因的穿梭质粒表达载体。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达黄绿荧光蛋白的生防菌，其特征在于：所述生防菌为重组菌，宿主菌为野生型生防菌株BS-17，宿主菌中转化有含黄绿荧光蛋白基因的穿梭质粒表达载体。


2.根据权利要求1所述的表达黄绿荧光蛋白的生防菌，其特征在于：所述含黄绿荧光蛋白基因的穿梭质粒表达载体，其结构为，在pHPS9质粒的lacZ基因和CmR基因之间的双酶切位点连接有EYFP基因。


3.根据权利要求2所述的表达黄绿荧光蛋白的生防菌，其特征在于：所述双酶切位点位于pHPS9质粒的lacZ基因下游，CmR基因上游。


4.根据权利要求3所述的表达黄绿荧光蛋白的生防菌，其特征在于：所述pHPS9质粒为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体，含有CmR基因、ORI332基因、PxylR基因、lacZ基因，从上游到下游依次的顺序为CmR基因、ORI332基因、PxylR基因、lacZ基因，lacZ基因在CmR基因的上游；所述EYFP基因为增强型黄绿荧光蛋白基因。


5.根据权利要求4所述的表达黄绿荧光蛋白的生防菌，其特征在于：所述双酶切位点为BamHI酶切与EcoRI酶的双酶切位点。


6...

【专利技术属性】
技术研发人员：王峥鉴，
申请(专利权)人：王峥鉴，
类型：发明
国别省市：北京;11