一种利用固定化酶制备β-丙氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用固定化酶制备β‑丙氨酸的方法，首先制备固定化酶，通过含有天冬氨酸酶变体基因的菌株进行发酵、发酵液浓缩、细胞破碎、高分子化合物载体加入、固定化酶收集，即可获得固定化酶；其次利用固定化酶制备β‑丙氨酸，以丙烯酸和氨水为底物，通过固定化酶催化、脱色、蒸发浓缩、脱水、干燥，即得β‑丙氨酸。本发明专利技术不仅酶利用率高，而且可有效降低副产物的生成，同时本发明专利技术工艺简单，能耗低，产物易分离，产品品质高，所得产品纯度最高可达到99.5％以上，有利于β‑丙氨酸的工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种利用固定化酶制备β-丙氨酸的方法
本专利技术属于丙氨酸的制备
，尤其涉及一种利用固定化酶制备β-丙氨酸的方法。
技术介绍
β-丙氨酸(β-alanine)即3-氨基丙酸(3-aminopropanoic)，是自然界中唯一存在的β型非蛋白氨基酸，β-丙氨酸作为一种重要的生化原料，其在医药、饲料以及食品领域都有着十分广泛的应用。现有技术中，国内外企业主要以化学合成法生产β-丙氨酸，如丙烯腈法、β-氨基丙腈法以及琥珀酰亚铵降解法。采用上述的化学合成法生产β-丙氨酸时会环境的污染较为严重，特别采用含腈原料，对环境及生物体都有极大的毒性。随着我国及全球环保要求的不断提高，为了避免环境污染问题，尝试采用生物法合成β-丙氨酸成为各大科研院所的研究和开发的热点。专利CN103898033.A公开了一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)，该酶可立体特异性地脱去L-天冬氨酸α位上的羧基，生成β-丙氨酸和二氧化碳。产物中β-丙氨酸的浓度达到59.4g/L，该浓度高压现有报道的基因工程菌的合成能力，但离实际工业化生产还有一定的距离。专利申请号CN102851333.A公开了一种同时利用天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的混合酶体系生成β-丙氨酸的方法，该方法可以较为廉价的富马酸为底物，经天冬氨酸酶催化生成天冬氨酸，然后所得的天冬氨酸再经L-天冬氨酸-α-脱羧酶催化脱羧生成β-丙氨酸。该专利技术由于酶活力较低，大肠杆菌细胞添加量需要达到20～50g/L，增加了后续菌体分离的成本。无论是直接或间接地利用天冬氨酸为底物进行转化，反应中都伴随有副产物二氧化碳的生成。由L-天冬氨酸到β-丙氨酸的质量转化率约为66.93％，较低的质量转化率增加了其生产成本。利用丙烯酸氨化生成β-丙氨酸是一直以来被认为是最为理想的合成方法，该方法具有工艺简单，收率高等优点。专利ZL200310109379.1公开了一种氨基化酶，该酶可催化丙烯酸加氨生成β-丙氨酸，所得成品的纯度可达98％，然而其丙烯酸转化率仅为60％左右。此外，大量残留的丙烯酸会促进主要副产物3’3-亚氨基二丙酸的产生，增加后续提取纯化工艺的难度，并影响最终的产品纯度。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种利用固定化酶催化制备β-丙氨酸的方法。通过固定化酶的形式进行转化反应，可提高酶的利用率，同时可有效防止副产物的生成，并解决传统全细胞转化过程中的细胞裂解杂质多，后提取工艺复杂，成本高，产品色度高等问题。其中所用含有天冬氨酸酶变体基因的菌株为中国专利201710659654.9中公开菌株中的至少一种，发酵条件与专利201710659654.9中公开的发酵条件相同。为达上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：1、固定化酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)使用含有天冬氨酸酶变体基因的菌株进行发酵；(2)将下罐发酵液浓缩至OD550150～350；(3)将浓缩后的发酵液进行细胞破碎；(4)向细胞破碎液中加入0.5g～1.5g高分子化合物载体，置于20～75℃的恒温摇床上，振荡2～8h；(5)将振荡后的混合液过滤，收集载有酶的高分子化合物，即为固定化酶；(6)向固定化酶中加入1倍体积的缓冲液，搅拌均匀，过滤除杂，收集固定化酶，重复上述步骤1～2次。进一步的，所述步骤(2)中下罐发酵液浓缩可采用离心浓缩或微滤浓缩，其中离心浓缩可采用管式离心机或蝶式离心机等，参照现有行业通用控制技术条件对发酵液中的菌体进行浓缩，微滤浓缩可采用陶瓷膜或超滤膜等，参照现有行业通用控制条件实现对发酵液中的菌体的浓缩。进一步的，所述步骤(3)中细胞破碎方式可为超声破碎、高压匀浆破碎、研磨破碎中的至少一种，优选高压匀浆破碎。进一步的，所述高压匀浆破碎的具体条件为：压力600～1000bar，温度0～30℃，破碎次数1～5次。进一步的，所述步骤(4)中所述高分子化合物载体为氨基树脂或环氧基树脂中的至少一种，其粒径为300～1000微米。进一步的，所述步骤(5)中的混合液过滤可采用20～100目的滤网。进一步的，所述步骤(6)中所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液的至少一种，其浓度为0.2～2mol/L。催化丙烯酸和氨水合成β-丙氨酸的酶(以下简称“β-丙氨酸合成酶”)是一种胞内酶。利用超声破碎、高压匀浆破碎、研磨破碎等方法将细胞破碎，使β-丙氨酸合成酶从胞内充分游离出来。通过高分子化合物载体的固定化作用，将β-丙氨酸合成酶与高分子化合物载体结合即得固定化酶。通过纯水洗涤固定化酶，可去除残留的细胞碎片、杂蛋白、核酸等杂质；采用浓度不小于0.2M的缓冲液浸泡洗涤固定化酶，可有效防止反应过程中的高渗透压环境造成的树脂脱水现象。2、利用固定化酶制备β-丙氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)向固定化酶中加入1倍体积的缓冲液，搅拌均匀后加入填充柱中；(2)转化：将步骤(1)中含有固定化酶的填充柱pH值调至8.0～11.0，然后将丙烯酸和氨水混合后的溶液作为底物加入到填充柱中，控制底物经过填充柱的时间为0.5～5h，流速2～20mL/min，反应温度为40℃～70℃；所述丙烯酸浓度为500～5600mM，用氨水调节其pH值至8.0～11.0；(3)水按一定流速加入到填充柱中，进行洗脱，收集液体样品；其中，水的流速与底物经过填充柱的流速保持一致；(4)对步骤(3)中所得转化液进行减压脱氨，控制蒸发器的真空度-0.07至-0.10Mpa，温度为50℃～60℃，操作时间30～60分钟；(5)脱色：向步骤(4)所得液体中加入活性炭，每升转化液中活性炭的加入量为0.5～2.0g，脱色温度控制在40～75℃，脱色时间20～180分钟，抽滤得到脱色清液；(6)蒸发浓缩：将步骤(5)中所得的脱色清液蒸发浓缩至β-丙氨酸质量浓度达到70％～95％，得到浓缩精浆；(7)脱水、干燥：将步骤(6)中得到的浓缩精浆进行脱水、干燥，得到的结晶即为β丙氨酸。进一步的，所述步骤(2)中调节含有固定化酶填充柱pH值所用的碱液可为pH9.0～11.0的缓冲液或pH9.0～11.0的氨水，其中优选pH9.0～11.0的氨水。进一步的，所述步骤(7)中浓缩精浆脱水的方法可采用离心、真空抽滤或离心与真空抽滤相结合的方式。底物通过含有固定化酶的填充柱时，一方面可有效阻止新生成的β-丙氨酸的返混，造成高浓度的β-丙氨酸与底物中的丙烯酸接触，从而反应产生副产物3’3-亚氨基二丙酸；另一方面树脂自身所具有的截留过滤功能可有效减少反应脱落的酶和色素等杂质进入到产物溶液中。其中，丙烯酸合成β-丙氨酸的转化率＝(用于合成β-丙氨酸的丙烯酸摩尔量)/(用于合成β-丙氨酸的丙烯酸摩尔量+用于合成3’3-亚氨基二丙酸的丙烯酸摩尔量)与传统全细胞转化工艺和批式转化工艺方法相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)同传统全细胞转化工艺相比，本专利技术采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制备β-丙氨酸的固定化酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)使用含有天冬氨酸酶变体基因的菌株进行发酵；/n(2)将下罐发酵液浓缩至OD

【技术特征摘要】
1.一种用于制备β-丙氨酸的固定化酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)使用含有天冬氨酸酶变体基因的菌株进行发酵；
(2)将下罐发酵液浓缩至OD550150～350；
(3)将浓缩后的发酵液进行细胞破碎；
(4)向细胞破碎液中加入0.5～1.5g高分子化合物载体，置于20～75℃的恒温摇床上，振荡2～8h；
(5)将振荡后的混合液过滤，收集载有酶的高分子化合物，即为固定化酶；
(6)向固定化酶中加入1倍体积的缓冲液，搅拌均匀，过滤除杂，收集固定化酶，重复上述步骤1～2次。


2.如权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中下罐发酵液浓缩可采用离心浓缩或微滤浓缩。


3.如权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中细胞破碎方式可为超声破碎、高压匀浆破碎、研磨破碎中的至少一种。


4.如权利要求3所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述高压匀浆破碎的具体条件为：压力600～1000bar，温度0～30℃，破碎次数1～5次。


5.如权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述高分子化合物载体为氨基树脂或环氧基树脂中的至少一种，其粒径为300～1000微米。


6.如权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中混合液过滤可采用20～100目的滤网。


7.如权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液的至少一种，其浓度为0.2～2mol/L。

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志成，刘洋，李瑞峰，田宋魁，
申请(专利权)人：秦皇岛华恒生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13