基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒及其使用方法。本发明专利技术的试剂盒可以直接在临床材料中检测有临床意义的曲霉菌种，包括烟曲霉和土曲霉。本发明专利技术的试剂盒还可以进一步检测烟曲霉中的两种多唑抗性机制。当与其他临床和实验室检查结合使用时，本发明专利技术的试剂盒检测结果有助于血液学和重症监护病房患者的侵袭性肺曲霉菌病的诊断。

【技术实现步骤摘要】
基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及曲霉菌检测领域，具体地涉及基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒及其使用方法。
技术介绍
曲霉菌广泛分布于环境中。据不完全统计人体每天吸入的曲霉孢子可达数百个之多。对于免疫缺陷体，例如器官移植患者、癌症患者及艾滋病而言，没有及时清除吸入的孢子，易导致侵袭性肺曲霉病(IPA)。95％以上的IPA是由烟曲霉感染导致的，其次为土曲霉。IPA以肺部感染为主，病死率超过70％。其临床表现与他原因肺炎、结核相似，无特异性，病情重、治疗方案不统一，极易误诊漏诊。因此早期诊断是改善曲霉菌感染患者的预后、降低病死率的关键。根据2016年美国感染病学会(IDSA)公布的曲霉病治疗指南，伏立康唑被推荐为治疗侵袭性曲霉病的首选药物，其他抗真菌如两素B和卡泊芬净等作为后备药物使用。但是由于全球范围内含唑类农药的大规模应用，以及临床上唑类抗真菌药物的长疗程使用，烟曲霉对伏立康等剂耐性呈逐年上升趋势。据文献显示，临床菌株耐药率在美国约为3.6％，中国为4％，日本为11％。目前临床上的IPA检测方法包括直接镜、培养和血清免疫学，但存在主观性强、培养时间长且敏感不高、血清学法灵度低的缺点。目前虽然针对曲霉开发了许多基于PCR快速检测的方法，但这些方法主要针对食源、药源的曲霉。专门针对引发临床疾病的曲霉检测方法已知有例如CN109055502A公开的基于真菌游离DNA的侵袭性真菌感染快速多重PCR鉴定诊断检测方法。该方法可鉴定由临床常见和高发的白色念珠菌、热带假丝酵母、近平滑假丝酵母、克柔念珠菌、光滑念珠菌及烟曲霉造成的侵袭性感染。再例如，CN105018575A公开的多重PCR在败血症真菌检测中的应用。其设计了一种多重PCR体系，能够弥补已有真菌检测方法的不足，为发病急、死亡率高的真菌性败血症及脓毒症临床治疗提供明确的用药信息，从而赢得宝贵的治疗时间。综上所述，目前还没有专门用于同时检测烟曲霉、土曲霉和曲霉耐药的检测方法。
技术实现思路
针对现有技术中的至少部分技术问题，本专利技术提供能够快速检测IPA致病曲霉菌并分型的试剂盒及其使用方法。优选地，本专利技术进一步提供能够对IPA致病菌耐药性进行检测的试剂盒。具体地，本专利技术包括以下内容。本专利技术的第一方面，提供一种基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其包含能够以混合物形式存在的通用引物和特异性探针组，其中，所述通用引物能够结合至曲霉属真菌的基因保守区，从而能够在实时荧光PCR中扩增源自曲霉属真菌的保守片段，所述特异性探针组包括能够与所述保守片段的部分序列互补结合的第一探针、第二探针和第三探针，所述第一探针能够与源自烟曲霉的序列特异性互补结合，所述第二探针能够与源自土曲霉的序列特异性互补结合，所述第三探针能够与源自曲霉属真菌的保守序列特异性互补结合。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其中，第一探针包含对应于第一通道的荧光染料，第二探针包含对应于第二通道的荧光染料和第三探针包含对应于第三通道的荧光染料。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其中，所述混合物溶解于缓冲液中，且所述缓冲液包含190-210mMTris-HCl、190-210mMKCl、90-110mM(NH4)2SO4、5-10mMMgSO4，且pH值为8.0-8.5。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒进一步包含内部质控和阳性质控。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其中，所述通用引物的序列如SEQIDNO：1和2所示，所述第一探针的序列如SEQIDNO：3所示，所述第二探针的序列如SEQIDNO：4所示，所述第三探针的序列如SEQIDNO：5所示。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒进一步包含针对烟曲霉耐药位点的引物和探针，且针对烟曲霉耐药位点的正向引物与反向引物的摩尔比为1:(8-10)，针对烟曲霉耐药位点的探针设计为与野生型探针的Tm差值为2。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其中，所述烟曲霉耐药位点选自CYP51A基因中的TR34、L98H、Y121F和T289A组成的组中的至少一种。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒进一步包括热启聚合酶。本专利技术的第二方面，提供试剂盒的使用方法，其包括使用所述通用引物和所述特异性探针组构建反应体系的步骤，和对所述反应体系进行PCR扩增的步骤。在某些实施方案中，根据本专利技术的使用方法，其中，所述PCR扩增包括：(1)预变性步骤，条件为2分钟、95℃；(2)循环反应步骤，条件为15秒、94℃变性，60秒、58℃退火、延伸，共30-50个循环；(3)熔解步骤：45℃、90秒，然后由45℃梯度升温至85℃。本专利技术的试剂盒可以直接在临床材料(如BAL，血清)中检测有临床意义的曲霉菌种，包括烟曲霉和土曲霉。优选地，本专利技术的试剂盒还可以进一步检测烟曲霉中的两种多唑抗性机制。当与其他临床和实验室检查结合使用时，本专利技术的试剂盒检测结果有助于血液学和重症监护病房(ICU)患者的侵袭性肺曲霉菌病(IPA)的诊断。附图说明图1不同聚合酶对于扩增结果的影响。Takara热启酶(A)，OmniKlentaq(B)，LC480mix(C)。图2L98(A)、TR34(B)、T289(C)和Y121(D)4个位点发生突变和野生型的烟曲霉熔解曲线峰图。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。本专利技术的试剂盒不仅能够一次性检测出样本中是否存在曲霉属微生物，而且还能区别是烟曲霉，还是土曲霉。优选地，本专利技术的试剂盒还能够进一步鉴定烟曲霉是否存在耐药性突变。本专利技术的试剂盒可构建多重实时荧光PCR反应的反应体系。试剂盒包含能够以混合物形式存在的通用引物和特异性探针组。其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，包含能够以混合物形式存在的通用引物和特异性探针组，其中，所述通用引物能够结合至曲霉属真菌的基因保守区，从而能够在实时荧光PCR中扩增源自曲霉属真菌的保守片段，所述特异性探针组包括能够与所述保守片段的部分序列互补结合的第一探针、第二探针和第三探针，所述第一探针能够与源自烟曲霉的序列特异性互补结合，所述第二探针能够与源自土曲霉的序列特异性互补结合，所述第三探针能够与源自曲霉属真菌的保守序列特异性互补结合。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，包含能够以混合物形式存在的通用引物和特异性探针组，其中，所述通用引物能够结合至曲霉属真菌的基因保守区，从而能够在实时荧光PCR中扩增源自曲霉属真菌的保守片段，所述特异性探针组包括能够与所述保守片段的部分序列互补结合的第一探针、第二探针和第三探针，所述第一探针能够与源自烟曲霉的序列特异性互补结合，所述第二探针能够与源自土曲霉的序列特异性互补结合，所述第三探针能够与源自曲霉属真菌的保守序列特异性互补结合。


2.根据权利要求1所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，第一探针包含对应于第一通道的荧光染料，第二探针包含对应于第二通道的荧光染料和第三探针包含对应于第三通道的荧光染料。


3.根据权利要求1所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，所述混合物溶解于缓冲液中，且所述缓冲液包含190-210mMTris-HCl、190-210mMKCl、90-110mM(NH4)2SO4、5-10mMMgSO4，且pH值为8.0-8.5。


4.根据权利要求1所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，进一步包含内部质控和阳性质控。


5.根据权利要求1所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，所述通用引物的序列如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱丽媛，杨晓明，夏小凯，黄迎燕，程天龄，吉斯·丁格曼斯，
申请(专利权)人：上海捷诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31