用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的KASP引物制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的KASP引物。本发明专利技术KASP引物由引物1(特异性片段为SEQ ID No.1的第22‑37位)、引物2(特异性片段为SEQ ID No.1的第22‑36位)和引物3(SEQ ID No.3)组成。本发明专利技术利用KASP技术对与水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6紧密连锁的SNP位点进行基因快速分型鉴定，可以高中低通量应用于商业化分子育种；其表型选择效率达91.3％，可在水稻不同种质资源中实现快速、精准检测；且操作简单，减少有毒物的使用，可在育种早期进行分子标记辅助选择，减小育种群体的田间种植规模，降低育种成本，加快育种进程。

【技术实现步骤摘要】
用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的KASP引物
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的KASP引物。
技术介绍
水稻黑条矮缩病是以灰飞虱为主要传播媒介的病毒病，具有暴发性、间歇性、迁移性等特点，水稻一旦感染很难有效控制，被称为水稻的“癌症”。近年来，水稻黑条矮缩病在我国东部江浙地区和亚洲东部国家发生，导致严重减产。选育水稻抗黑条矮缩病品种是防治水稻黑条矮缩病的最为有效、环保的方法之一。在传统抗黑条矮缩病品种选育过程中，每代都需要采用田间接种病菌的方法鉴定中间材料的基因型，而且环境条件会影响到正确中间材料的选择，这样势必影响选育进程；同时如果接种过程操作不当还会造成病原扩散，不利于黑条矮缩病的综合防治，因此抗病品种选育难的问题一直没有彻底解决。分子标记辅助选择技术(Marker-assistedSelection，MAS)是现代分子生物学和传统遗传育种相结合的新型育种模式，可以利用分子标记在植物发育的任何时期从DNA水平对目标植株进行选择(Tanksley等，RFLPmappinginplantbreeding:Newtoolsforanoldscience.1989,Biotechnology,7:257-263)，从而弥补传统育种中出现的诸多弊端，因此成为解决抗病品种选育难这一问题的有效途径。其中，利用高通量分子检测平台进行分子标记辅助选择则是增加抗病育种准确度与提高育种效率的有效手段。单核苷酸多态性(Single-nucleotidepolymorphism，SNP)是指基因组核苷酸序列中由单个核苷酸水平上的变异而引起的基因组水平上的DNA序列多态性，主要包括单个碱基的缺失、插入、转换及颠换等(唐立群等，SNP分子标记的研究及其应用进展.2012,中国农学通报,28(12):154-158.)。基于SNP位点设计的标记即为在此基础上发展起来的第三代分子标记，该标记类型具有突变频率低，遗传稳定性高；位点丰富，分布广泛；检测快速，筛选规模化等特点。与第二代分子标记相比，KASP标记不需要根据DNA片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐，低通量，价格又较贵的检测方法。因此，更加适用于现阶段飞速发展的高通量分子检测平台。水稻黑条矮缩病抗性是由多基因控制的数量性状，其抗性基因多分布于3、6、7、9号染色体上。其中3号染色体QTL位于分子标记RM7和RM5748之间(WangBX,JiangL,ChenLM,etal.ScreeningofRiceResourcesagainstRiceBlack-StreakedDwarfVirusandMappingofResistantQTL[J].ActaAgronomicaSinica,2010,36(8):1258-1264)；6号染色体有两个QTLs，qRBSDV6.3位于20Mb处的分子标记Y19.3和Y6之间(FengZ,KangH,LiM,etal.Identificationofnewricecultivarsandresistancelociagainstriceblack-streakeddwarfvirusdiseasethroughgenome-wideassociationstudy[J].Rice,2019,12(1))，qRBSDV6位于0.1Mb处的LOC_Os06g03120基因处(XiaoS,WangB,LiuY,etal.Genome-wideassociationstudyandlinkageanalysisonresistancetoriceblack-streakeddwarfvirusdisease[J].MolecularBreeding,2019,39(5))；7号和9号染色体的QTLs分别位于分子标记RG128与R1440之间、RG570与RM215之间(LiA,PanC,WuL,etal.IdentificationandfinemappingofqRBSDV-6,amajorQTLforresistancetoriceblack-streakeddwarfvirusdisease[J].MolecularBreeding,2013,32(1):1-13)。上述水稻黑条矮缩病抗性QTLs连锁标记虽然可以用于分子标记辅助选择，但均为SSR标记或InDel标记，检测效率相对较低，并不适用于高通量的分子检测平台。因此，开发适合于高通量分子检测平台的水稻抗黑条矮缩病KASP分子标记对于推广普及分子标记技术的应用、提高我国的育种效率和育种水平具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的KASP引物。第一方面，本专利技术要求保护用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的KASP引物。本专利技术所要求保护的用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的KASP引物由引物1、引物2和引物3组成；所述引物1为自5’端到3’端依次为标签序列A和SEQIDNo.1的第22-37位的单链DNA；所述引物2为自5’端到3’端依次为标签序列B和SEQIDNo.2的第22-36位的单链DNA；所述引物3为核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.3所示的单链DNA。所述KASP引物具体用于检测水稻第6号染色体的第1,153,858位点处核苷酸多态性(A或者C)。进一步地，所述标签序列A的核苷酸序列可为SEQIDNo.1的第1-21位；所述标签序列B的核苷酸序列可为SEQIDNo.2的第1-21位。更进一步地，所述引物1具体可为核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的单链DNA；所述引物2具体可为核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的单链DNA。第二方面，本专利技术要求保护用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的试剂或试剂盒。本专利技术所要求保护的用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的试剂或试剂盒中含有第一方面中所述的KASP引物。进一步地，所述试剂或试剂盒中还可含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B。所述荧光探针A的核苷酸序列与所述标签序列A的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列与所述标签序列A的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。所述荧光探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。在本专利技术的具体实施方式中，所述荧光基团A为VIC；所述荧光基团B为FAM；所述淬灭基团为Dabcy1。在本专利技术中，所述荧光探针A、所述荧光探针B、所述淬灭探针A和所述淬灭探针B是存在于2×KASPMix中的，其中所述2×KASPMix为英国LGC公司产品。第三方面，本专利技术要求保护前文所述的KASP引物或前文所述的试剂或试剂盒在如下任一中的应用：(A)鉴定或辅助鉴定水稻对黑条矮缩病抗性；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的KASP引物，其特征在于：所述KASP引物由引物1、引物2和引物3组成；所述引物1为自5’端到3’端依次为标签序列A和SEQ ID No.1的第22-37位的单链DNA；所述引物2为自5’端到3’端依次为标签序列B和SEQ ID No.2的第22-36位的单链DNA；所述引物3为核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的KASP引物，其特征在于：所述KASP引物由引物1、引物2和引物3组成；所述引物1为自5’端到3’端依次为标签序列A和SEQIDNo.1的第22-37位的单链DNA；所述引物2为自5’端到3’端依次为标签序列B和SEQIDNo.2的第22-36位的单链DNA；所述引物3为核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.3所示的单链DNA。


2.根据权利要求1所述的KASP引物，其特征在于：所述标签序列A的核苷酸序列为SEQIDNo.1的第1-21位；所述标签序列B的核苷酸序列为SEQIDNo.2的第1-21位。


3.根据权利要求1或2所述的KASP引物，其特征在于：所述引物1为核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的单链DNA；所述引物2为核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的单链DNA。


4.用于检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒中含有权利要求1-3中任一所述的KASP引物。


5.根据权利要求4所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；
所述荧光探针A的核苷酸序列与所述标签序列A的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列与所述标签序列A的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团；
所述荧光探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。


6.根据权利要求5所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述荧光基团A为VIC；所述荧光基团B为FAM；所述淬灭基团为Dabcy1。


7.权利要求1-3中任一所述的KASP引物或权利要求4-6中任一所述的试剂或试剂盒在如下任一中的应用：
(A)鉴定或辅助鉴定水稻对黑条矮缩病抗性；
(B)检测或辅助检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型；
(C)比较待测水稻对黑条矮缩病抗性强弱；
(D)选育对黑条矮缩病抗性相对较强的水稻单株或株系或品系或品种；
(E)选育对黑条矮缩病抗性相对较弱的水稻单株或株系或品系或品种。


8.一种检测或辅助检测水稻黑条矮缩病抗性基因qRBSDV6的基因型的方法，包括如下步骤：用权利要求5或6所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰国防，马刚，陶菊红，柯瑷，徐扬，俞良，潘斌清，唐乐尧，王小虎，王雪刚，季向东，李标，
申请(专利权)人：常熟市农业科学研究所，扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32