棉花内生真菌CEF-082抑制棉花黄萎病菌活性组分的分离方法技术

本发明专利技术涉及农业生物技术领域，具体涉及分离棉花内生真菌CEF‑082的抑制棉花黄萎病菌的活性组分的方法。CEF‑082代谢粗提物对棉花黄萎病菌具有抑菌活性。CEF‑082代谢粗提物中分离到的chaetoviridin A能显著抑制大丽轮枝菌微菌核的萌发，促进大丽轮枝菌细胞内H

【技术实现步骤摘要】
棉花内生真菌CEF-082抑制棉花黄萎病菌活性组分的分离方法
本专利技术涉及农业生物
，具体涉及分离棉花内生真菌CEF-082的抑制棉花黄萎病菌的活性组分的方法。
技术介绍
棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的土传维管束病害。利用有益微生物控制植物病害的发生危害具有经济、环境友好的特点。生防菌通常可利用竞争、抗生、寄生和交叉保护等直接的拮抗机制抑制植物病害；同时某些生防菌还能促进植物生长，诱导植物产生对真菌、细菌和病毒引起的病害的抗性，称为诱导系统抗性(ISR)，又称获得性抗病性，是植物在一定的生物或非生物因子的刺激或作用下，产生对随后病原物侵染的抗性。目前利用拮抗微生物防治棉花黄萎病研究较多的是枯草芽孢杆菌，作用机理是产生杆菌肽等多种抗菌物质来抑制病原菌，对黄萎病的防治具有一定的效果，但是在生产应用中存在不少问题，其中最主要的问题是防治效果较低。球毛壳菌作为一种生防真菌，现在已经被认为是结构多样性天然产物的重要来源，主要包括球毛壳素类化合物、吲哚生物碱类化合物、吡啶酮类、萜类化合物、黄酮类化合物等。现有技术研究发现棉花内生真菌球毛壳菌CEF-082对棉花黄萎病具有较好的防效，但是未能确定棉花内生真菌球毛壳菌CEF-082中抑制棉花黄萎病菌的活性组分。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供分离棉花内生真菌CEF-082的抑制棉花黄萎病菌的活性组分的方法。根据本专利技术的分离棉花内生真菌CEF-082的抑制棉花黄萎病菌的活性组分的方法包括以下步骤：CEF-082发酵液经过乙酸乙酯等体积萃取，旋转蒸干，得到粗提物；将粗提物与1.5倍质量的200-300目硅胶拌匀，用10倍质量的硅胶做柱子填料，干法上样，进行梯度洗脱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，洗脱比例分别为100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16、100:32，然后用纯甲醇冲洗柱子，TLC进行合并，共得到了5个组分，1-5号，1号洗脱的比例是100:0和100:1，2号的洗脱比例是100:1，3号的洗脱比例是100:2，4号的洗脱比例是100:2，5号的洗脱比例是100:2和100:4，其中用CH2Cl2和MeOH的混合物(v/v，100:0；100:1)洗脱，得到一个组分(1号，2.6g)，活性最强。然后将该组分用石油醚和乙酸乙酯的混合物(v/v，15:1，1L；v/v，10:1，1L；v/v，5:1，1L和v/v，3:1，1L)进行硅胶柱色谱洗脱，TLC进行合并，得到7个组分，F-1洗脱比例主要是15:1，F-2洗脱比例是10:1，F-3洗脱比例主要是10:1，F-4洗脱比例主要是5:1，F-5洗脱比例主要是3:1，F-6和F-7是有纯乙醇洗脱的；结果只有F-2对大丽轮枝菌有较好的活性，在活性追踪方法下分离纯化后得到纯化合物2，鉴定该种化合物为chaetoviridinA，化学式为C23H25ClO6。本专利技术从棉花的内生真菌球毛壳菌CEF-082代谢物入手，通过分离、筛选、鉴定、抑菌测定，获得对棉花黄萎病具有显著控制作用的物质chaetoviridinA。利用棉花的内生真菌CEF-082代谢物来控制棉花黄萎病在以下三方面产生有益效果。1、CEF-082代谢粗提物对棉花黄萎病菌具有抑菌活性。牛津杯试验，CEF-082发酵粗提物能产生抑菌圈，且2mg/mL时对黄萎病菌的生长具有显著的抑制效果。2、CEF-082代谢粗提物中分离到的chaetoviridinA能显著抑制大丽轮枝菌微菌核的萌发，促进大丽轮枝菌细胞内H2O2和NO积累，并且使细胞坏死，抑制菌丝生长。降解细胞壁，使大丽轮枝菌对逆境的敏感性增强。3、CEF-082代谢粗提物中分离到的chaetoviridinA还能增强棉花植株对黄萎病菌的防御反应。4、CEF-082为环境友好型生防菌株。CEF-082属于子囊菌亚门、核菌纲、球壳目、黑孢壳科、毛壳菌属，在自然界中广泛存在，并对土壤中的有害微生物产生拮抗作用。本专利技术中CEF-082代谢粗提物对棉花植株生长具有促进作用，对作物安全，环境友好。附图说明图1显示CEF-082粗提物对V.dahliaeVd080孢子的抑制作用，A，粗提物抑制Vd080孢子萌发；B，A中的孢子和菌丝进行冷冻扫描电镜观察；a、b、c为对照组，d、e、f为粗提物处理组。图2显示孢子横切形状，a为CK；b、c为CEF-082粗提物处理样品；图3显示不同浓度CEF-082粗提物对Vd080孢子萌发及菌丝的抑菌活性，A，粗提物处理大丽轮枝菌Vd0804d后；B，粗提物处理大丽轮枝菌Vd0806d后；a和d为对照(甲醇处理)，b、c、e、f分别代表浓度为2、3、4、5mg/mL的粗提物处理组；图4显示大丽轮枝菌Vd080对逆境的敏感性提高，大丽轮枝菌浓度从左到右依次是1×107spores/mL、1×106spores/mL、1×105spores/mL、1×104spores/mL和1×103spores/mL；图5显示抑菌活性检测，各组分浓度为2×104ug/mL。1、2、3、4、5、6(粗提物)、CK抑菌圈直径分别为2.1、1.7、1.5、1.4、1.5、2.2、0.8cm；图6显示5个组分抑菌活性检测，各组分浓度为2.5mg/mL,1、2、3、4、5、6、7、8(粗提物)、CK菌落直径分别为1.5、0、1.5、1.6、1.6、1.6、1.7、1.6、1.6cm；图7显示化合物2chaetoviridinA的结构式；图8显示ChaetoviridinA对大丽轮枝菌微菌核萌发的抑制作用，A，chaetoviridinA处理后微菌核的萌发(3列代表3个重复)；B，chaetoviridinA处理后微菌核的萌发率；C，微菌核萌发后的外观；图9显示ChaetoviridinA对大丽轮枝菌Vd080菌丝和孢子的影响，A，ChaetoviridinA对菌丝体的影响，绿色箭头表示正常菌丝体，红色箭头表示皱缩菌丝。B，用chaetoviridinA处理孢子Vd080后细胞坏死。FITC标记的是凋亡+坏死细胞(绿色)，PI标记的是坏死细胞(红色)，Bar＝10μm；图10显示ChaetoviridinA处理后的NO和ROS生成，A，chaetoviridinA处理后的ROS生成。绿色表示NO，Bar＝10μm，B，chaetoviridinA处理后的NO生成。绿色表示ROS的生成，Bar＝10μm；图11为大丽轮枝菌细胞壁相关基因表达量热图，注：绿色代表下调的基因，红色代表上调的基因，黑色代表基因表达没有变化；图12显示ChaetoviridinA处理棉花24hROS积累情况，注：ChaetoviridinA的浓度为150μg/mL。具体实施方式实施例1粗提物对大丽轮枝菌Vd080孢子的抑制作用将PDA上生长的CEF-082菌块，接种到含有400mLPDB的1000m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离棉花内生真菌CEF-082的抑制棉花黄萎病菌的活性组分的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n棉花内生真菌CEF-082的发酵液经过乙酸乙酯等体积萃取，旋转蒸干，得到粗提物；/n将粗提物与硅胶拌匀，做柱子填料，干法上样，进行梯度洗脱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，洗脱比例分别为100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16、100:32，然后用纯甲醇冲洗柱子，TLC进行合并，共得到了5个组分，为1-5号，1号洗脱的比例是100:0和100:1，2号的洗脱比例是100:1，3号的洗脱比例是100:2，4号的洗脱比例是100:2，5号的洗脱比例是100:2和100:4，其中用v/v为100:0和100:1的CH

【技术特征摘要】
1.一种分离棉花内生真菌CEF-082的抑制棉花黄萎病菌的活性组分的方法，其特征在于，包括以下步骤：
棉花内生真菌CEF-082的发酵液经过乙酸乙酯等体积萃取，旋转蒸干，得到粗提物；
将粗提物与硅胶拌匀，做柱子填料，干法上样，进行梯度洗脱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，洗脱比例分别为100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16、100:32，然后用纯甲醇冲洗柱子，TLC进行合并，共得到了5个组分，为1-5号，1号洗脱的比例是100:0和100:1，2号的洗脱比例是100:1，3号的洗脱比例是100:2，4号的洗脱比例是100:2，5号的洗脱比例是100:2和100:4，其中用v/v为100:0和100:1的CH2Cl2和MeOH的混合物洗脱，得到一个组分(1号，2.6g)，活性最强。
然后将该组分...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱荷琴，张芸，唐灿明，冯自力，叶永浩，冯鸿杰，魏锋，赵丽红，张亚林，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，南京农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41