检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合、检测试剂及检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物检测领域，特别涉及检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合、检测试剂及检测试剂盒。本发明专利技术提供的底物组合基于生化和显色原理的快速区分大肠埃希菌和志贺菌的检测试剂盒及其制备方法。使用本发明专利技术所述试剂盒，仅需一步操作，即能在1～2h内快速区分大肠埃希菌和鲍氏志贺菌、宋内志贺菌、福氏志贺菌、痢疾志贺菌。

【技术实现步骤摘要】
检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合、检测试剂及检测试剂盒
本专利技术涉及生物检测领域，特别涉及检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合、检测试剂及检测试剂盒。
技术介绍
微生物鉴定是食品、药品、海关及临床检验工作中的重要部分。主要方法包括：(1)基于生化反应谱的生化鉴定:生化鉴定因涉及较多的生化反应，目前已经发展出生化鉴定系统，基于细菌培养及不同细菌表现不同的生化谱实现种属鉴定，鉴定结果准确，可以精确到种甚至亚种，但鉴定细菌种类及速度不及测序技术及质谱技术。(2)基于16sRNA测序的测序技术：测序技术是根据细菌的基因16sRNA序列不同实现不同种属的鉴定，因其高通量、准确性高被各检验机构所使用。(3)基于蛋白质图谱的质谱鉴定等。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-AssistedLaserDesorption/IonizationTimeofFlightMassSpectrometry，MALDI-TOFMS)检测微生物蛋白质特征指纹谱，与数据库中的微生物特征蛋白谱比较，确定微生物的种属。特点是快速，操作简便，准确性高。但对于后面两种技术，有些细菌无法准确区分，比如大肠埃希菌和志贺菌，因为序列比较相似，蛋白图谱基本一致，16sRNA测序及质谱技术无法进行区分。所以如果想要很准确的区分，需要一些特殊处理或者补充实验。大肠埃希菌和志贺菌属于近缘微生物，大肠埃希菌多数为正常肠道菌群，而志贺菌为致病菌，临床检验时区分志贺菌和大肠埃希菌意义重大。现有专利《一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法》(专利号；CN110144379A)描述了针对这一技术缺陷的专利技术专利，此专利技术是将生化鉴定原理与MALDI-TOFMS技术相结合，将志贺菌和大肠埃希菌培养于含有乳糖或者不含乳糖的培养条件下，诱导大肠埃希菌在不同生长条件下产生差异蛋白，再通过MALDI-TOFMS技术检测差异蛋白，根据差异蛋白检测结果判断是否为大肠埃希菌或志贺菌，实现近亲缘性志贺菌和大肠埃希菌的快速鉴别。上述鉴定方法(1)所述生化鉴定，可以准确区分大肠埃希菌和志贺菌，但所需时间较长；上述鉴定方法(2)和(3)无法准确区分大肠埃希菌和志贺菌。因大肠埃希菌和志贺菌属16sRNA序列比较相似，16SrRNA基因全长仅1-2个碱基的区别，无法用测试技术区分。蛋白图谱基本一致，故无法用质谱法对这两种菌进行准确区分。MALDI-TOFMS或者16SrRNA测序鉴定大肠和志贺菌后需要特殊处理或补充的生化试验进行最终鉴定。专利CN110144379A采用特殊处理的方法，需要提前将待测样本进行组分差异化培养2h-24h以达到菌株特异性蛋白表达，然后再将差异培养后的菌株进行质谱前处理，上机进行质谱鉴定，整个操作过程涉及再次培养、质谱前处理、质谱二次鉴定，步骤繁琐且耗时长。专利CN110144379A还有一个严重的不足之处：该技术方案中只能鉴定区分为大肠埃希菌和志贺菌属，如为志贺菌属，只能鉴定到属水平，无法鉴定到到志贺菌属下面的具体种。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合、检测试剂及检测试剂盒。该底物组合基于生化和显色原理的快速区分大肠埃希菌和志贺菌的检测试剂盒及其制备方法。使用本专利技术所述试剂盒，仅需一步操作，即能在1～2h内快速区分大肠埃希菌和鲍氏志贺菌、宋内志贺菌、福氏志贺菌、痢疾志贺菌。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合，包括第一底物组合、第二底物组合、第三底物组合和第四底物组合；所述第一底物组合包括：0.8％～1.2％甘露醇、1.4％～1.7％酸碱指示剂和缓冲体系，pH值7.2～7.4；所述第二底物组合包括：0.8％～1.2％糖苷或其与酚类结合的化合物和缓冲体系，pH值7.0～8.0；所述第三底物组合包括：0.8％～1.2％甜味剂、1.4％-1.7％酸碱指示剂和缓冲体系，pH值7.2～7.4；所述第四底物组合包括：0.5％～1％甘油、1.4％-1.7％酸碱指示剂和缓冲体系，pH值7.2～7.4。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述第一底物组合、所述第三底物组合或所述第四底物组合中的所述酸碱指示剂包括苯酚红、苯酚红衍生物或溴甲酚紫中的一种或两者以上的组合物；所述苯酚红衍生物包括苯酚红钠。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述第二底物组合中的所述糖苷包括ONPG(2-硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)、β-D-半乳吡喃糖苷或α-D-半乳吡喃糖苷中的一种或两者以上的组合物；所述酚类包括但不仅限于苯酚、硝基苯酚、萘酚、吲哚酚中的一种或两者以上的组合物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述第三底物组合中所述甜味剂包括：山梨醇、乳糖、木糖中的一种或两者以上的组合物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述缓冲体系包括但不限于：磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液中的一种或其组合。基于上述研究，本专利技术还提供了所述的底物组合在制备检测大肠埃希菌和/或志贺菌中的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述志贺菌包括鲍氏志贺菌、宋内志贺菌、福氏志贺菌、痢疾志贺菌中的至少一种。基于上述研究，本专利技术还提供了试剂，包括所述的底物组合以及可接受的助剂。本专利技术还提供了试剂盒，包括所述的底物组合以及可接受的助剂或载体；所述载体包括板卡。本专利技术还提供了大肠埃希菌或志贺菌的检测方法，包括如下步骤：步骤1：获得所述底物组合；步骤2：取待测菌，获得2.5～3麦氏的菌悬液；所述待测菌为大肠埃希菌或志贺菌；步骤3：取步骤1制得的所述底物组合与步骤2制得的菌悬液按照体积比(8～12)：(80～120)混合，35～37℃孵育1～2h；步骤4：根据步骤3孵育后的显色结果，分别获得所述第一底物组合、所述第二底物组合、所述第三底物组合和所述第四底物组合的阴性或阳性的判读结果；综合所述判读结果，获得检测结果；所述阴性或阳性的判读标准为：所述第一底物组合、所述第三底物组合或所述第四底物组合中，当所述酸碱指示剂为苯酚红或苯酚红衍生物时，显色结果为红色变成黄色，即判读阳性，反之为阴性；当所述酸碱指示剂为溴甲酚紫时，显色结果为紫色变成黄色，即判读阳性，反之为阴性；所述第二底物组合中，显色结果为无色变成黄色，即判读阳性，反之为阴性；综合所述判读结果，获得检测结果具体为：其中，“+”表示阳性；“-”表示阴性；“v”表示“+/-”。本专利技术提供了一种基于生化和显色原理的快速区分大肠埃希菌和志贺菌的检测试剂盒及其制备方法。使用本专利技术所述试剂盒，仅需一步操作，即能在1-2h内快速区分大肠埃希菌和鲍氏志贺菌、宋内志贺菌、福氏志贺菌、痢疾志贺菌。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。...

【技术保护点】
1.检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合，其特征在于，包括第一底物组合、第二底物组合、第三底物组合和第四底物组合；/n所述第一底物组合包括：0.8％～1.2％甘露醇、1.4％～1.7％酸碱指示剂和缓冲体系，pH值7.2～7.4；/n所述第二底物组合包括：0.8％～1.2％糖苷或其与酚类结合的化合物和缓冲体系，pH值7.0～8.0；/n所述第三底物组合包括：0.8％～1.2％甜味剂、1.4％-1.7％酸碱指示剂和缓冲体系，pH值7.2～7.4；/n所述第四底物组合包括：0.5％～1％甘油、1.4％-1.7％酸碱指示剂和缓冲体系，pH值7.2～7.4。/n

【技术特征摘要】
1.检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合，其特征在于，包括第一底物组合、第二底物组合、第三底物组合和第四底物组合；
所述第一底物组合包括：0.8％～1.2％甘露醇、1.4％～1.7％酸碱指示剂和缓冲体系，pH值7.2～7.4；
所述第二底物组合包括：0.8％～1.2％糖苷或其与酚类结合的化合物和缓冲体系，pH值7.0～8.0；
所述第三底物组合包括：0.8％～1.2％甜味剂、1.4％-1.7％酸碱指示剂和缓冲体系，pH值7.2～7.4；
所述第四底物组合包括：0.5％～1％甘油、1.4％-1.7％酸碱指示剂和缓冲体系，pH值7.2～7.4。


2.如权利要求1所述的底物组合，其特征在于，所述第一底物组合、所述第三底物组合或所述第四底物组合中的所述酸碱指示剂包括苯酚红、苯酚红衍生物或溴甲酚紫中的一种或两者以上的组合物；
所述苯酚红衍生物包括苯酚红钠。


3.如权利要求1或2所述的底物组合，其特征在于，所述第二底物组合中的所述糖苷包括ONPG(2-硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)、β-D-半乳吡喃糖苷或α-D-半乳吡喃糖苷中的一种或两者以上的组合物；
所述酚类包括但不仅限于苯酚、硝基苯酚、萘酚、吲哚酚中的一种或两者以上的组合物。


4.如权利要求1至3任一项所述的底物组合，其特征在于，所述第三底物组合中所述甜味剂包括：山梨醇、乳糖、木糖中的一种或两者以上的组合物。


5.如权利要求1至4任一项所述的底物组合，其特征在于，所述缓冲体系包括但不限于：磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液中的一种或其组合。


6.如权利要求1至5任一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔晓莉，郑业焕，方娟，吴小瑞，李晓帅，付光宇，吴学炜，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41