一种抗PLA2R的IgG与IgG4亚型抗体同时快速联合定量检测试纸及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗PLA2R的IgG与IgG4亚型抗体同时快速联合定量检测试纸及其制备方法，包括粘性底层、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；在硝酸纤维素膜上相间隔依次设置两个条带并列放置，分别为抗PLA2R抗体的IgG检测条带(T1)及兔抗兔多克隆抗体的质控带(C1)，与IgG4亚型抗体检测带(T2)及兔抗兔多克隆抗体的质控带(C2)，结合垫表面喷涂标记兔抗人IgG抗体的包裹铕离子的纳米微球以及标记抗人IgG4亚型抗体的包裹铕离子的纳米微球。本发明专利技术能够在一个时间分辨荧光免疫层析试纸上同时进行抗PLA2R抗体的IgG与IgG4亚型抗体的定量检测，一次检测操作，可以得到抗PLA2R‑IgG4和抗PLA2R‑IgG的浓度及两者的比值，简化了操作步骤，采用两个指标同时检测，其比值会更准确。

【技术实现步骤摘要】
一种抗PLA2R的IgG与IgG4亚型抗体同时快速联合定量检测试纸及其制备方法
本专利技术涉及生物
，具体为一种抗PLA2R的IgG与IgG4亚型抗体同时快速联合定量检测试纸及其制备方法。
技术介绍
膜性肾病(MN)是引起成人肾病综合征的最常见的病因之一，MN主要表现为蛋白尿。MN根据病因不同主要分为特发性膜性肾病(IMN)和继发性膜性肾病(SMN)。MN的诊断目前主要依据患者临床表症及肾脏活检病理结果。肾脏活检是MN诊断的金标准，但也存在损伤、感染、漏诊、不能区分部分IMN和SMN等不足。2009年，Beck等首次发现了存在于正常足细胞表面的M型磷脂酶A2受体(PLA2R)是IMN的最主要的靶抗原。IMN是一种自身免疫性疾病,以上皮下IgG的沉积为主。在IMN患者中，针对PLA2R的自身抗体主要为IgG4亚类。已有研究证实，在IMN患者的肾小球沉积物中有明显的IgG4沉积。在膜性狼疮性肾炎患者中，肾小球内的主要沉积物为IgG2和IgG3亚类；在乙型肝炎病毒相关性膜性肾病患者中，肾小球内的主要沉积物为IgG3亚类，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗PLA2R的IgG与IgG4亚型抗体同时快速联合定量检测试纸，其特征在于：包括粘性底层(1)、样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水纸(5)；/n所述粘性底层(1)上依次设置样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水纸(5)；其中硝酸纤维素膜(4)直接设置于粘性底层(1)上，结合垫(3)的后端搭接在硝酸纤维素膜(4)前端上，样品垫(2)的后端搭接在结合垫(3)的前端上，样品垫(2)的前端直接粘结在粘性底层(1)上；所述吸水纸(5)的前端搭接在硝酸纤维素膜(4)的后端上；/n其中硝酸纤维素膜(4)上平行设有检测带(T)和质控带(C)。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗PLA2R的IgG与IgG4亚型抗体同时快速联合定量检测试纸，其特征在于：包括粘性底层(1)、样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水纸(5)；
所述粘性底层(1)上依次设置样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水纸(5)；其中硝酸纤维素膜(4)直接设置于粘性底层(1)上，结合垫(3)的后端搭接在硝酸纤维素膜(4)前端上，样品垫(2)的后端搭接在结合垫(3)的前端上，样品垫(2)的前端直接粘结在粘性底层(1)上；所述吸水纸(5)的前端搭接在硝酸纤维素膜(4)的后端上；
其中硝酸纤维素膜(4)上平行设有检测带(T)和质控带(C)。


2.根据权利要求1所述的一种抗PLA2R的IgG与IgG4亚型抗体同时快速联合定量检测试纸，其特征在于：所述质控带(C)与检测带(T)之间相距0.5-0.6cm；检测带(T)与结合垫(3)之间的距离为0.5-0.6cm。


3.根据权利要求2所述的一种抗PLA2R的IgG与IgG4亚型抗体同时快速联合定量检测试纸，其特征在于：所述质控带(C)与检测带(T)分别为抗PLA2R抗体的IgG检测条带(T1)及兔抗兔多克隆抗体的质控带(C1)，与IgG4亚型抗体检测带(T2)及兔抗兔多克隆抗体的质控带(C2)。


4.根据权利要求1所述的一种抗PLA2R的IgG与IgG4亚型抗体同时快速联合定量检测试纸，其特征在于：所述结合垫(3)表面喷涂有兔抗人IgG抗体。


5.一种抗PLA2R的IgG与IgG4亚型抗体同时快速联合定量检测试纸的制备方法，其特征在于：包括
1)包裹镧系元素(Eu3+)的时间分辨荧光微球的制备：利用包覆技术分别将镧系元素稀土配合物包埋在微球中，合成具有核壳结构的复合微球。复合微球表面要光滑、尺寸分布均匀，其中的稀土离子可表现出很强的特征发光，与纯的稀土配合物相比量子效率、稳定性均有较大的提高。改变反应条件可制备大小在50-500纳米之间的复合微球，比较不同直径的微球的荧光强度，比较不同直径的微球的表面活性基团的结合能力等。
2)重组PLA2R抗原的制备：根据基因库中“PLA2R”的全序列构建各自的重组质粒，将293T细胞按70％-80％的密度铺到10cm细胞培养皿中，24h后转染；在500μl无血清培养基中，加入25μlMegaTran1.0和5μg带有flag标签的PLA2R质粒，混匀，室温静置20min。逐滴加到细胞培养皿，轻轻摇匀；转染48h后，弃掉培养基，加入裂解液，冰上裂解15min，收集lysate。
3)重组PLA2R抗原的纯化和鉴定：将偶联有flag抗体的柱料装入层析柱中；用5倍柱料体积TBST冲洗一遍，用1倍柱料体积0.1MpH3.5甘氨酸冲洗三遍，用10倍柱料体积TBST冲洗三遍，用10倍柱料体积LysisBuffer冲洗2遍；取lysate40ml，用0.45μm的滤膜过滤，上样3次；用10倍柱料体积LysisBuffer冲洗1遍，用10倍柱料体积TBST冲洗三遍，随后用500μl0.1MpH3.5甘氨酸洗脱，洗脱液加入1MpH9.0的Tris缓冲液调整pH值至7.3，加入10％甘油。纯化的重组PLA2R经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，考马斯亮蓝染色拍照，纯化的重组PLA2R对应的位置与标准对比得出分子量，重组PLA2R应在185kD附近。
4)制备纯化的抗PLA2R抗体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡志刚，杨雪，张文琛，
申请(专利权)人：无锡市儿童医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32