培养基及应用该培养基提高维生素PQQ转化率的方法技术

本发明专利技术涉及一种培养基及应用所述培养基对菌种进行发酵培养的方法，所述培养基通过在现有的通用培养基中添加适当重量的甲胺乙醇溶液和甲醛，甲胺和甲醛一部分通过丝氨酸循环进行碳固定，另一部分氧化成甲酸可以产生能量供甲基营养菌生长，物料配伍合理，碳源品种丰富，可有效加快生丝微菌胞内脱氢酶的生成而大量诱导合成PQQ，该培养基应用于PQQ的发酵生产中，有效提高从甲醇到PQQ的转化率。本发明专利技术所述的应用所述培养基对菌种进行发酵培养的方法，在三级扩大培养过程中，发酵培养80h后开始流加补料培养基，能有效加快生丝微菌胞内代谢活动，缩短代谢流路，提高脱氢酶的生成量，进一步提高了甲醇的利用率；且上述补料策略操作简便，适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
培养基及应用该培养基提高维生素PQQ转化率的方法
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种培养基及应用该培养基提高维生素PQQ转化率的发酵方法。
技术介绍
吡咯喹啉醌(Pyrroloquinolinequinone简称PQQ)是一种具有氧化还原活性的芳香三环邻位醌。PQQ是继黄素核苷酸FMN/FAD)和吡啶核苷酸(NAD/NADP)之后被发现的第三种氧化还原酶的辅因子，参与呼吸链的电子传递。PQQ具有促进机体生长、防护肝损伤、促进神经生长因子合成、调节机体自由基水平、提高细菌对毒性和辐射等极端条件的耐受性等功能，是一种独特的生理活性物质，在食品和医药保健领域具有重要的开发前景。PQQ的生产方法分化学合成法和生物合成法，但其合成步骤繁杂，产率低，副产物多，纯化成本高。而生物合成的方法具有成本低、步骤少、分离更为容易的优点，是PQQ产业化的主要方向。CN104745513B专利公开的培养基以甲醇为单一碳源培养4-6天，吡咯喹啉醌的产量仅为150-350mg/L，未达到1g/L；CN106282044B专利公开的培养基以甲醇为单一碳源，发酵过程补料工艺粗放简陋，不易于控制，虽然最终产物浓度达到1783mg/L，但耗用甲醇过多，转化率低。因此，开发新的培养基和提高维生素PQQ的转化率是微生物发酵生产PQQ进行工业化的关键。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了一种培养基及应用该培养基提高维生素PQQ转化率的发酵方法。本专利技术所述培养基，通过在现有的通用培养基中添加适当重量的甲胺乙醇溶液和甲醛，甲胺和甲醛一部分通过丝氨酸循环进行碳固定，另一部分氧化成甲酸可以产生能量供甲基营养菌生长，物料配伍合理，碳源品种丰富，可加快生丝微菌胞内脱氢酶的生成而大量诱导合成PQQ，该培养基应用于PQQ的发酵生产中，可以提高从甲醇到PQQ的转化率；进一步，应用所述培养基进行的PQQ发酵方法，通过控制补料策略，能有效加快生丝微菌胞内代谢活动，缩短代谢流路，提高脱氢酶的生成量，进而提高甲醇的利用率，且所述补料策略操作简便，适用于工业化生产。本专利技术所采用的技术方案为：一种培养基，原料组分包括无水甲醇0.1-2重量份、甲胺乙醇溶液0.1-0.5重量份、甲醛0.02-0.1重量份、(NH4)2SO40.5-1.0重量份、KH2PO40.1-0.5重量份、Na2HPO40.6-1.0重量份、MgSO4·7H2O0.1-0.3重量份、FeSO4·7H2O0.005-0.01重量份、ZnSO4·7H2O0.01-0.03重量份、CoCl2·6H2O0.005-0.01重量份、水100重量份。进一步优选所述培养基的原料还包括0.001-0.003重量份的辅酶Q10、0.01-0.05重量份的甘氨酸和0.01-0.03重量份的天冬酰胺；所述甲胺乙醇溶液的质量浓度为30％。一种提高维生素PQQ转化率的发酵方法，应用所述培养基对菌种进行发酵培养，从发酵液中获得PQQ。所述菌种为生丝微菌菌种。所述发酵培养包括三级扩大培养，具体步骤如下：(1)将菌种的种子液加入培养基中，进行一级扩大培养；(2)将一级扩大培养得到的菌液加入到培养基中，进行二级扩大培养；(3)将二级扩大培养得到的菌液加入到含培养基的发酵罐进行三级扩大培养。步骤(1)中，所述一级扩大培养的条件为在150rpm、34℃条件下进行振荡培养20-24h；步骤(2)中，所述二级扩大培养的条件为在150rpm、34℃条件下进行振荡培养18-22h。步骤(3)中，进行三级扩大培养时，搅拌速度为100-400rpm，最大通气比0.2-0.5vvm，0-80h发酵培养温度为33-35℃，80h后至结束发酵培养温度为30-32℃。步骤(3)中，发酵培养80h后开始流加补料培养基。所述补料培养基的组成为无水甲醇40％、甲胺乙醇溶液(质量浓度为30％)10％、甲醛5％、甲酸2％、甘氨酸0.5％，其余为水。所述补料培养基的加入总体积占所述发酵罐内培养基初始体积的25-40％；80h后所述补料培养基的流加策略如下：80h开始流加占所述发酵罐内培养基初始体积2％的补料培养基，之后每隔1h检测OD，OD每增加2流加占所述培养基初始体积1％的补料培养基，直至流加完全部的补料培养基。本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术所述的培养基，通过在通用培养基中添加适当重量的甲胺乙醇溶液和甲醛，生丝微菌一方面能够将甲醛、甲醇、甲胺乙醇中的一碳化合物氧化成二氧化碳从而提供能量(异化作用)，另一方面能够通过同化作用变成细胞自身的碳骨架，作为一碳化合物脱氢酶的辅因子—PQQ必须在生长代谢过程中随脱氢酶的生成而大量诱导合成，从而本专利技术所述培养基的物料配伍合理，碳源品种丰富，可有效加快生丝微菌胞内脱氢酶的生成而大量诱导合成PQQ，该培养基应用于PQQ的发酵生产中，有效提高从甲醇到PQQ的转化率。(2)本专利技术还提供一种培养基，在通用培养基中添加适当重量配比的甲胺乙醇溶液(30％浓度)和甲醛，甲胺和甲醛一部分通过丝氨酸循环进行碳固定，另一部分氧化成甲酸以产生能量供甲基营养菌生长，甘氨酸、辅酶Q10和天冬酰胺能够参与氧化磷酸化及ATP的生成过程，可作为细胞代谢和细胞呼吸的激活剂，提高抗氧化性，各组分协同发挥功效，将该培养基应用于PQQ的发酵生产中，进一步提高从甲醇到PQQ的转化率。数据显示，应用该培养基对生丝微菌进行发酵培养，甲醇转化率高达0.9％。(3)本专利技术所述的应用所述培养基对菌种进行发酵培养的方法，在三级扩大培养过程中，发酵培养80h后开始流加补料培养基，能有效加快生丝微菌胞内代谢活动，缩短代谢流路，提高脱氢酶的生成量，进一步提高了甲醇的利用率；且上述补料策略操作简便，适合工业化生产。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本专利技术所保护的范围。实施例1本实施例提供一种培养基，原料组分包括：无水甲醇1.5g、质量浓度为30％的甲胺乙醇溶液0.5g、甲醛0.1g、(NH4)2SO41.0g、KH2PO40.5g、Na2HPO41.0g、MgSO4·7H2O0.3g、FeSO4·7H2O0.01g、ZnSO4·7H2O0.03g、CoCl2·6H2O0.01g、辅酶Q100.003g、甘氨酸0.05g、天冬酰胺0.03g、水100g。应用所述培养基对生丝微菌进行发酵培养，具体步骤如下：(1)一级扩大培养：将生丝微菌甘油管保存的种子液加入培养基中，于150rpm、34℃条件下进行振荡培养22h；(2)二级扩大培养：将步骤(1)得到的菌液加入到培养基中，于150rpm、34℃条件下进行振荡培养20h；(3)三级扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培养基，其特征在于，原料组分包括无水甲醇0.1-2重量份、甲胺乙醇溶液0.1-0.5重量份、甲醛0.02-0.1重量份、(NH

【技术特征摘要】
1.一种培养基，其特征在于，原料组分包括无水甲醇0.1-2重量份、甲胺乙醇溶液0.1-0.5重量份、甲醛0.02-0.1重量份、(NH4)2SO40.5-1.0重量份、KH2PO40.1-0.5重量份、Na2HPO40.6-1.0重量份、MgSO4·7H2O0.1-0.3重量份、FeSO4·7H2O0.005-0.01重量份、ZnSO4·7H2O0.01-0.03重量份、CoCl2·6H2O0.005-0.01重量份、水100重量份。


2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，原料还包括0.001-0.003重量份的辅酶Q10、0.01-0.05重量份的甘氨酸和0.01-0.03重量份的天冬酰胺；
所述甲胺乙醇溶液的浓度为30％。


3.一种提高维生素PQQ转化率的发酵方法，其特征在于，应用权利要求1-3任一项所述培养基对菌种进行发酵培养，从发酵液中获得PQQ。


4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述菌种为生丝微菌菌种。


5.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养包括三级扩大培养，具体步骤如下：
(1)将菌种的种子液加入培养基中，进行一级扩大培养；
(2)将一级扩大培养得到的菌液加入到培养基中，进行二级扩大培养；
(3)将二级扩大培养得到的菌液加...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐冲，余卫雄，楼慧强，吴雷，
申请(专利权)人：安徽新熙盟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34