来自玉米事件CA09328的核酸分子及其检测方法技术

本发明专利技术涉及来自玉米事件CA09328的核酸分子及其检测方法，用于检测该核酸分子的引物组、探针及试剂盒，以及产生自玉米事件CA09328的玉米制品。本发明专利技术的玉米事件CA09328可稳定表达目的基因且表达量强，全生育期抗玉米螟效果优秀，且具有良好的安全性。

【技术实现步骤摘要】
来自玉米事件CA09328的核酸分子及其检测方法相关申请的交叉引用本申请要求于2020年9月24日提交的申请号为CN202011021485.4、专利技术名称为“来自玉米事件CA09328的核酸分子及其检测方法”的专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
本专利技术总体上涉及植物分子生物学、植物转化、以及植物育种的领域，具体涉及来自玉米事件CA09328的核酸分子及其检测方法。
技术介绍
玉米(拉丁学名：ZeamaysL.)在世界上很多地区都是主要的粮食作物。通过生物技术改善玉米的农艺性状和品质已有相关研究。其中，如何在玉米中产生昆虫抗性，特别是对玉米螟虫、棉铃虫、黏虫等的抗性，同时对环境不产生有害作用，是一个重要的研究方向。其中，一种实现的方法是通过转基因的方式将特定的昆虫抗性基因在玉米植物中表达从而使玉米植物获得相应的昆虫抗性。例如国际公开号为WO2005059103A1、WO2013169923A1公开的技术等。然而，外源基因在植物中的表达以及是否能实现抗虫效果受到该基因在植物染色体中的具体位置的影响。具体而言，外源基因在染色体上的位置不同，会对该外源基因是否表达以及相应的表达量也会有很大差异，在表达的空间和时间模式上也可能存在差异，例如不同植物组织之间转基因的相对表达存在差异，这种差异表现在实际的表达模式可能与根据导入的基因构建体中的转录调节元件所预期的表达模式不一致。其原因可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。因此，为了得到最优的表达，通常需要筛选大量的玉米事件，如此才可能鉴定出可以商业化的事件，即以商业化为目的从大量的事件中筛选出具有目标基因表达量和表达模式的单一事件。具有预期转基因表达量和表达模式的事件可以采用常规的育种方法通过有性异型杂交将转基因渗入到其他遗传背景中，通过杂交的方式产生的后代可以保持原始转化体的转基因表达特征。应用这种策略模式可以确保品种中具有可靠的基因表达，而这些品种能很好地适应当地的生长条件。因此，鉴定外源基因在基因组中的整合位点对转基因作物的应用具有重要意义。能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是有益的。在转基因安全评价中，外源基因在基因组中的整合位点是必须提供的信息。整合位点是通过与插入的转基因DNA相邻的染色体DNA(或基因组DNA)的序列(即，侧翼DNA序列)来表征的。目前，主要通过PCR技术鉴定分析外源基因的整合位点，包括质粒拯救法、反向PCR(IPCR)法、TAIL-PCR(热不对称交错PCR)法、PCR-walking法等等。TAIL-PCR技术简单易行，反应高效灵敏，产物特异性好，重复性好，应用较为广泛。例如Xu等通过TAIL-PCR方法分离了水稻转基因事件Bt-ZJ22中外源基因整合位点3'端旁侧序列，并根据旁侧序列建立了TaqMan实时定量PCR鉴定方法(XuJ等，QualitativedetectionandquantificationofaCry1A(b)transgenepresentinricecv.Zhejing22,Europeanfoodresearchandtechnology,2011,233:259-266)。对于有性杂交的后代以及用其制备的产品，需要检测其是否包含特定的玉米事件的存在，以便确定有性杂交的后代是否包含目的基因。例如来源于基因重组农作物的食物在投放入市场前需要获得正式批准和进行标记。可以通过多种现有的多核苷酸的检测方法来检测植物中转基因的存在，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或者利用多核苷酸探针的DNA杂交。本专利技术人的中国专利ZL201010552618.0中已公开了一种人工合成Bt抗虫基因Cry1Ab-t。该专利提供了一种编码来自于苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的Bt编码基因Cry1Ab，该基因在作物中可以稳定表达，具有较好的抗虫效果。但是，该专利并未对其提供的Bt抗虫基因Cry1Ab-t在染色体上的不同位置对表达量所造成的影响进行研究，因此，缺乏该抗虫基因在染色体上的不同位置对玉米抗虫能力影响的评估。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，专利技术人对该Cry1Ab-t基因继续进行研究，得到具有单拷贝转基因、良好的遗传稳定性、高抗亚洲玉米螟、双丙胺磷除草剂耐受性等优秀特性的玉米事件CA09328。因此，本专利技术的目的是提供一种来自玉米事件CA09328的核酸分子及其检测方法，其可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含特定转基因玉米事件CA09328的DNA分子。为实现上述目的，本专利技术提供了如下方面的技术方案。在本专利技术的第一方面，提供了一种核酸分子，其来自玉米事件CA09328，所述核酸分子包括：SEQIDNO：1或其互补序列、和/或SEQIDNO：2或其互补序列；其中，所述玉米事件CA09328中包括异源DNA分子，所述异源DNA分子包括Cry1Ab-t基因表达盒和bar基因表达盒；所述Cry1Ab-t基因表达盒包括：用作Cry1Ab-t基因启动子的CaMV35S启动子、Cry1Ab-t基因编码框、用作Cry1Ab-t基因终止子的T-Nos终止子；所述bar基因表达盒包括：用作bar基因启动子的CaMV35S启动子、bar基因编码框、作为bar基因终止子的CaMVpoly(A)信号。SEQIDNO：1为玉米事件CA09328中插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为20个核苷酸的DNA序列，其中依次包括10个来自于玉米基因组的核苷酸和10个来自于插入的异源DNA分子(即T-DNA)的核苷酸，因此，所述SEQIDNO：1或其互补序列跨越了玉米事件CA09328中异源DNA分子插入位点的侧翼基因组DNA序列和异源DNA分子的5’末端序列，并且包含所述SEQIDNO：1或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件CA09328的存在。类似地，SEQIDNO：2为玉米事件CA09328中插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为20个核苷酸的DNA序列，其中依次包括10个来自于插入的异源DNA分子(即T-DNA)的核苷酸和10个来自于玉米基因组的核苷酸，因此，所述SEQIDNO：2或其互补序列跨越了玉米事件CA09328中异源DNA分子插入位点的异源DNA分子的3’末端序列和侧翼基因组DNA序列，并且包含所述SEQIDNO：2或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件CA09328的存在。进一步地，本专利技术所提供的核酸分子进一步包括SEQIDNO：3或其互补序列、和SEQIDNO：4或其互补序列。SEQIDNO：3是玉米事件CA09328中插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的长度为1726个核苷酸的DNA序列，其中SEQIDNO：3的碱基1-1248属于插入接合部位附近的玉米基因组，碱基1249-1726属于插入接合部位附近的异源DNA分子(即T-DNA)的核苷酸的5’末端，因此，所述SEQIDNO：3或其互补序列跨越了玉米事件CA09328中异源DNA分子插入位点的侧翼基因组DNA序列和异源DNA分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸分子，其来自玉米事件CA09328，所述核酸分子包括：SEQ ID NO：1或其互补序列、和/或SEQ ID NO：2或其互补序列；/n其中，所述玉米事件CA09328中包括异源DNA分子，所述异源DNA分子包括Cry1Ab-t基因表达盒和bar基因表达盒；/n所述Cry1Ab-t基因表达盒包括：用作Cry1Ab-t基因启动子的CaMV35S启动子、Cry1Ab-t基因编码框、用作Cry1Ab-t基因终止子的T-Nos终止子；所述bar基因表达盒包括：用作bar基因启动子的CaMV35S启动子、bar基因编码框、作为bar基因终止子的CaMV poly(A)信号。/n

【技术特征摘要】
20200924 CN 20201102148541.一种核酸分子，其来自玉米事件CA09328，所述核酸分子包括：SEQIDNO：1或其互补序列、和/或SEQIDNO：2或其互补序列；
其中，所述玉米事件CA09328中包括异源DNA分子，所述异源DNA分子包括Cry1Ab-t基因表达盒和bar基因表达盒；
所述Cry1Ab-t基因表达盒包括：用作Cry1Ab-t基因启动子的CaMV35S启动子、Cry1Ab-t基因编码框、用作Cry1Ab-t基因终止子的T-Nos终止子；所述bar基因表达盒包括：用作bar基因启动子的CaMV35S启动子、bar基因编码框、作为bar基因终止子的CaMVpoly(A)信号。


2.根据权利要求1所述的核酸分子，其包括：SEQIDNO：3或其互补序列、和SEQIDNO：4或其互补序列。


3.根据权利要求1所述的核酸分子，其包括SEQIDNO：5或其互补序列。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的核酸分子，其中，所述玉米事件CA09328以保藏号CGMCCNo.19967保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。


5.一种用于检测样品中存在根据权利要求1-4中任一项所述的核酸分子的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)使所述样品与引物组接触，并进行核酸扩增反应；
(2)检测核酸扩增所得到的扩增子中是否含有SEQIDNO：1和/或SEQIDNO：2所示的核酸分子。


6.一种用于根据权利要求5所述的方法的引物组，所述引物组中包括第一引物组和第二引物组，其中所述第一引物组包含引物1F和引物1R，所述第二引物组包含引物2F和引物2R，并且同时满足下列条件：
(i)所述引物1F为SEQIDNO：3的碱基1-1248中连续的11-30个碱基，优选连续的15-30个碱基，更优选连续的18-27个碱基，并且所述引物1R为SEQIDNO：3的碱基1249-1726中连续的11-30个碱基，优选连续的15-30个碱基，更优选连续的18-27个碱基的反向互补序列，并且所述第一引物组扩增的扩增子中包含SEQIDNO：1；以及

【专利技术属性】
技术研发人员：铁健雄，
申请(专利权)人：广州哈维种业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44