编码杀虫蛋白的抗虫融合基因m1cry1ab-mgcry1f、其表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种编码杀虫蛋白的抗虫融合基因m1cry1ab

【技术实现步骤摘要】
编码杀虫蛋白的抗虫融合基因m1cry1ab
‑
mgcry1f、其表达载体及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种编码杀虫蛋白的抗虫融合基因m1cry1ab
‑
mgcry1f、其表达载体及其应用。

技术介绍

[0002]随着全球粮食危机的升级，对粮食作物产量提高的需求愈发旺盛。然而以农作物为食的害虫数量大、种类多，严重影响作物产量和品质，造成巨大经济损失。目前农作物害虫的防治仍依赖于化学农药的施用，而长期大量使用化学农药对环境污染和人类健康的危害已受到广泛关注。随着分子生物学技术的发展和基因克隆、DNA编辑技术的出现，人类开始将抗虫基因克隆到工程菌中，进一步获得抗性转基因植株，其中很多已进入大田试验，有的已经开始大面积种植。
[0003]当利用生物技术开发新型药剂成为研究方向时，优良目标基因的选择和克隆则成为该项基因工程研究的基础。现有抗虫基因的克隆主要有：
[0004]苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)抗虫基因：Bt在形成芽孢的过程中产生杀虫蛋白晶体，敏感性昆虫摄取后，在中肠碱性条件下被水解为多肽，可使细胞膜上形成孔道，进而破坏细胞的离子平衡，最终导致细胞裂解，致使昆虫死亡；蛋白酶抑制剂基因：对维持生物体正常代谢和预防外来蛋白水解酶对基体的破坏起着重要作用，可抑制昆虫肠道蛋白酶活性，造成昆虫消化不良，最终因缺乏氨基酸，生长发育受限继而死亡；植物凝集素基因：含二价金属离子的糖蛋白，可使昆虫，尤其是刺吸式口器的昆虫，红细胞发生凝聚作用，进而引发死亡；几丁质酶基因：几丁质是真菌细胞壁、昆虫外壳的重要组成部分，几丁质酶是一种广泛存在于植物中的内源性蛋白质，具有抵御病原性真菌、食草昆虫的重要作用；蝎昆虫毒素基因：可特异性结合昆虫神经细胞膜上的钠离子通道，引起钠离子的通透性改变，从而使昆虫麻痹、死亡。
[0005]目前从大量的Bt菌株中分离出至少90种基因编码的杀虫结晶蛋白。昆虫病原菌Bt基因产生Cry、Cyt和Vips等3种蛋白。Cry和Cyt蛋白产生聚集在包涵体或旁孔晶体中的杀虫蛋白，Cry蛋白根据蛋白结构同源性和寄主范围，将这些基因划分为CryI、CryII、CryIII和CryIV 4个主要类型。其中，CryI高抗鳞翅目昆虫，CryII抗鳞翅目和双翅目昆虫，CryⅢ高抗鞘翅目昆虫，CryIV抗双翅目昆虫。近年又相继发现了兼抗鳞翅目和鞘翅目的Bt毒蛋白(CryV)、抗线虫的Bt毒蛋白(CryVI)。大多数苏云金芽孢杆菌株系可产生几种杀虫结晶蛋白，但每一种杀虫结晶蛋白寄主范围相当狭窄。
[0006]但是，上述转抗虫基因的抗虫植物在应用中的潜在问题也日益显露，影响其持续利用。如：将原始抗虫基因直接应用到转基因植物中获得的转基因植物抗虫性很低、抗虫性效果差，毒蛋白的表达量低且表达产物不稳定，不能满足农业生产上的虫害防治需求，大多难以推广应用；随着抗虫基因的大范围应用，昆虫还会对杀虫蛋白产生抗性；抗虫基因的抗虫谱窄；外源基因在植物体内的表达存在基因“沉默”现象，等等。
[0007]因此，研发新的抗虫基因或充分利用现有抗虫基因资源，通过基因重组或融合技术应对昆虫对杀虫制剂的抗药性趋势，已成为当务之急。

技术实现思路

[0008]为了选择并改造出优良的抗虫基因，本专利技术人设计出编码杀虫蛋白的抗虫融合基因，并将其或其表达载体应用于抗虫植物细胞或抗虫制剂中，以解决昆虫对杀虫制剂的抗药性趋势不可遏制的技术问题，为植物害虫防治提供更多样化的技术手段。
[0009]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0010]在本专利技术的一个方面，提供一种抗虫基因m1Cry1ab，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0011]还提供一种抗虫基因mgCry1f，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0012]在上述序列的基础上，本专利技术人通过长期大量的试验和实践经验，提供一种抗虫融合基因m1cry1ab
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mgcry1f，其核苷酸序列为：
[0013](1)如SEQ ID NO：6所示的核酸序列；或
[0014](2)由SEQ ID NO：6所示的核酸序列衍生的具有同等功能的核酸序列。
[0015]在本专利技术的另一方面，提供一种抗虫融合基因编码的蛋白m1cry1ab
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mg cry1f，其氨基酸序列为：
[0016](1)如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；或
[0017](2)在SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的基础上进行一个或几个氨基酸残基的添加、缺失或替换而获得的活性片段或保守变体的序列。
[0018]在本专利技术的另一个方面，本专利技术人结合实用特性进一步提供一种由所述抗虫融合基因m1cry1ab
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mgcry1f构建的表达载体、以及由所述表达载体构建的重组菌。
[0019]本专利技术还涉及所述抗虫融合基因m1cry1ab
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mgcry1f在制备抗虫植物细胞中的应用。
[0020]优选的，所述植物为单子叶植物。更优选的，所述单子叶植物为玉米、水稻、小麦、燕麦、大麦、青稞、粟、高粱和甘蔗。优选的，所述植物为棉花、蔬菜或果树。
[0021]本专利技术还涉及所述抗虫融合基因编码的蛋白m1cry1ab
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mgcry1f在制备抗虫制剂中的应用。
[0022]本专利技术还涉及产生转基因植物的方法，其中用本专利技术所述的表达载体或所述的重组菌转化植物，得到转基因植物。
[0023]本专利技术还涉及杀死鳞翅目害虫的方法，包括使所述鳞翅目害虫进食杀虫有效量的通过本专利技术所述方法获得的转基因植物。优选的，所述鳞翅目害虫为亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)或草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)。
[0024]本专利技术还涉及减轻鳞翅目害虫对植物的伤害的方法，包括将表达载体稳定整合进植物的基因组，所述表达载体包含编码抗鳞翅目害虫基因的核酸分子，所述核酸分子包括如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
[0025]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0026]1.本专利技术优选具有改进潜力的抗虫基因，重新设计、改造得到了全新的抗虫基因m1CryAb和抗虫基因mgCry1f，使得上述基因可以显著提高杀虫蛋白的表达量。特别的，本发
明的抗虫基因MgCry1F与原始Cry1F序列比较，改造后的基因设计了缺失和DNA序列改变，并在基因的前面加上Adh I增强子，大大增强了其在植物中的表达。使用植物偏爱性密码子，减少了原始DNA序列中的富含AT序列和存在的反向重复序列以及不明确的真核DNA内含子序列。改造后的MgCry1F基因与原始Cry1F基因序列相比，同源性为69％，G+C含量由30.89％提高到48.78％。本专利技术的抗虫基因MgCry1F能在植物细胞中高效稳定的表达。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种改造优化的抗虫基因Cry1f，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。2.一种抗虫融合基因m1cry1ab
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mgcry1f，其特征在于，其核苷酸序列为：(1)如SEQ ID NO:6所示的核酸序列；或(2)由SEQ ID NO:6所示的核酸序列衍生的具有同等功能的核酸序列。3.一种抗虫融合基因编码的蛋白m1cry1ab
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mgcry1f，其氨基酸序列为：(1)如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；或(2)在SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的基础上进行一个或几个氨基酸残基的添加、缺失或替换而获得的活性片段或保守变体的序列。4.一种由如权利要求2所述抗虫融合基因m1cry1ab
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mgcry1f构建的表达载体。5.一种由如权利要求4所述的表达载体构建的重组菌。6.一种如权利要求2所述的抗虫融合基因m1cry1ab
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mgcry1f在制备抗虫植物细胞中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述单子叶植物为玉米、水稻、小麦、燕麦、...

【专利技术属性】
技术研发人员：铁健雄，
申请(专利权)人：广州哈维种业有限公司，
类型：发明
国别省市：